第 28 卷第 4 期 2006 年 8 月
吉 林 农 业 大 学 学 报 Journal of Jilin Agricultural University
Vol128 No14 August 2006
菌株 MY02 发酵培养基的优化设计Ξ
刘 秋 , 闫建芳 , 艾 勇 , 于基成 , 杨宝灵 , 范圣第
Optimization of Fermentation Culture Medium of Isolate MY02
LIU Qiu , YAN J ian2fang , AI Yong , YU J i2cheng , YANG Bao2ling , FAN Sheng2di ( Research Center of Biotechnology , Dalian Nationalities University , Dalian 116600 , China) Abstract : Active components SN06 in fermentation of Streptomyces rimosus MY02 show antagonism a2 gainst pathogen1 It is a basic implementation for production of SN06 that screens medium ingredients and corresponding dosage1 In this study , the optimum medium ingredients and dosage of Streptomyces rimosus MY02 were determined using uniform design combined with regression analysis1 A regression model was developed1 The optimum medium was starch 2169 % , peanut steep powder 1139 % , (NH4) 2SO4 0118 % , CaCO3 0114 % and NaCl 0116 %1The regression model was tested with titre of SN06. The tested result fitted well with those calculated with the model1 The results confirmed the applicability of uniform design for screening the best medium ingredients for SN061 Key words : Streptomgces rimosus ; agricultural antibiotic ; uniform design experiment ; fermentation con2
琼脂 118 %。原始发酵培养基 : 豆粉 313 % ,淀粉 710 % , (NH4) 2SO4 014 % ,CaCO3 014 % ,NaCl 014 % , pH 712～714 (灭菌前) 。检测培养基 ( PDA) :马铃 薯 200 g ,葡萄糖 20 g ,琼脂 18 g ,蒸馏水 1 000 mL 。 113 菌株 MY02 发酵液的制备
源时 ,其发酵液的抑菌圈直径最大 ,为 36131 mm。 在进行均匀试验设计时 ,花生饼粉质量分数设计 为 012 %～314 %。
A1 花生饼粉 Peanut steep powder ; B1 豆粉 Soya bean steep pow2 der ; C1 玉米粉 Corn powder ; D1 酵母粉 Yeast extract ; E1 蛋白 胨 Peptone ; F1 氨水 Ammonia ; G1 (NH4) 2SO4
行试验设计 ,共 17 个水平 (处理 1～1基 , 分 装 于 250 mL的三角瓶中 ,每个处理重复 3 次 ,效价检测 方法同本文“114”。 11713 回归模型验证 根据获得的回归方程进 行逐步回归分析 ,将得到的最佳培养基配方重新 发酵 ,测得的效价与将最佳配方用量分别代入回 归方程计算的理论效价作比较 ,验证最佳发酵配 方 ,同时验证回归方程的可靠性 。
的基础 。本 试 验 拟 通 过 单 因 子 及 均 匀 试 验 对 SN06 的摇瓶发酵条件进行优化 ,为进一步的中试 放大及大规模生产提供必要的前提 。
1 材料与方法
111 菌种 试验用菌株为大连民族学院微生物工程实验
室自番茄保护地分离的 1 株链霉菌菌株 ,经鉴定 为龟裂链霉菌 ( Streptomyces rimosus) MY02 菌株 。 活性检测指示菌为番茄叶霉病菌 ( Fulvia f ulva) 。
(大连民族学院生物工程研究中心 , 大连 116600)
摘 要 : 以龟裂链霉菌 MY02 菌株为试材 ,采用单因子试验与均匀试验相结合的方法 ,通过二次多项式回归分 析 ,筛选出活性组分 SN06 最佳发酵培养基配方 ,并建立了多元二次回归数学模型 。菌株 MY02 优化发酵培养 基的最佳配方 :淀粉质量分数为 2169 % ,花生饼粉质量分数为 1139 % , (NH4) 2SO4质量分数为 0118 % ,CaCO3质 量分数为 0114 % ,NaCl 质量分数为 0116 %。根据回归模型计算出 SN06 理论效价与实测效价相比较 ,二者非 常接近 ,拟合误差小 。 关键词 : 龟裂链霉菌 ; 农用抗生素 ; 均匀设计试验 ; 发酵条件 中图分类号 : Q932335 文献标识码 : A 文章编号 : 100025684 (2006) 0420361204
Ξ 基金项目 : 辽宁省自然科学基金资助项目 (20022085) ,辽宁省教育厅高等学校科学研究项目 (2004F079) 作者简介 : 刘 秋 (19692) ,女 , 博士 ,副教授 ,主要从事植物病原微生物研究 。 收稿日期 : 2005207207 修回日期 : 2005212210
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
第 28 卷 第 4 期
刘 秋等 : 菌株 MY02 发酵培养基的优化设计
363
粉 、黄豆粉 、玉米粉的生物效价最高 (图 2) 。考虑 到生产成本及其他元素的含量变化对菌株 MY02 产素的影响 ,选用花生饼粉做进一步的均匀试验 , 以确定更好的发酵培养基配方 。
otic production
在以淀粉为碳源的条件下 ,菌株 MY02 在无 机氮源及以花生饼粉 、黄豆粉 、玉米粉 、酵母粉 、蛋 白胨为有机氮源的情况下均能合成 SN06 ,其中以 花生饼粉为最好 ,其他依次为黄豆粉 、玉米粉 、酵 母粉 、蛋白胨 、氨水 、(NH4) 2SO4 。在试验的几种氮 源中 ,有机氮源明显好于无机氮源 ,尤其以花生饼
制备菌株 MY02 的孢子悬浮液 ,使最终浓度 为 104 个/ mL 。按 10 %的接种量接入发酵培养基 内 ,然后置于 28 ℃、160 r/ min 的摇床上培养 96 h 。 发酵结束后将发酵液加热至沸腾后冷却 ,取15 mL 于 6 000 r/ min 的离心机上离心15 min ,取上清液 进行抑菌活性测定 。 114 抑菌活性测定
A1 麦芽糖 Maltose ; B1 淀粉 Starch ; C1 蔗糖 Sucrose D1 糊精 Dextrin ; E1 葡萄糖 Glucose ; F1 乳糖 Lactose
图 1 不同碳源对菌株 MY02 产素的影响 Fig111 Influence of different carbon source s on antibi2
产素的影响试验 在碳源筛选的基础上 ,测定不同质量分数的 淀粉及花生饼粉对菌株 MY02 产素的影响 。用 2 % ,4 % ,6 % ,8 % ,10 % 的淀粉分别替换原始发 酵培养基中的淀粉 ,以 1 % ,2 % ,3 % ,4 % ,5 % 的 花生饼粉分别替换原始发酵培养基中的豆粉 ,均 以原始发酵培养基作对照 ,测定不同质量分数的 淀粉 、花生饼粉对菌株 MY02 产素的影响 。根据 试验结果设计均匀试验的不同水平数 。 117 均匀试验设计 11711 原 料 选 择 选 择 淀 粉 、花 生 饼 粉 、 (NH4) 2SO4 、NaCl 、CaCO3 5 个因素的不同水平 ,采 用均匀试验设计[5] ,确定菌株 MY02 的最优化发 酵培养基配方 。各成分用量按表 1 配制 ,所有成 分设 17 个用量水平 。 11712 按均匀设计法确定配方 配方共有 5 个 因素 ( X1～ X5) ,按方开泰[5] 报道的均匀设计法进
dition
新 型 农 用 抗 生 素 SN06 是 由 龟 裂 链 霉 菌 ( Streptomyces rimosus) MY02 菌株产生的一种多烯 大环内酯类抗生素[1] 。该抗生素对多种蔬菜真菌 病害 (如番茄叶霉病 、灰霉病 、黄瓜枯萎病 、茄子黄 萎病等) 都有较好的防治效果[2] 。目前对龟裂链 霉菌报道较多的是其能够产生抑制各种细菌生长 的重要抗生素 ———土霉素 ,但土霉素对真菌的生 长没有抑制作用 。目前关于龟裂链霉菌能够产生 抑制植物病原真菌生长的代谢产物的报道较 少[3] 。筛选龟裂链霉菌产生的抗真菌活性组分 SN06 的优化发酵培养基是高效 、大量生产 SN06
2 结果与分析
211 不同碳 、氮源对菌株 MY02 产素的影响 菌株 MY02 在以乳糖作为碳源的情况下 ,几
乎不能合成 SN06 ,而以淀粉 、糊精 、葡萄糖 、麦芽 糖作为碳源时 ,均能有效地合成 SN06 ,其抑菌圈 直径 从 高 到 低 依 次 为 麦 芽 糖 > 淀 粉 > 蔗 糖 > 糊精 > 葡萄糖 > 乳糖 。其中在以麦芽糖作为碳源 的发酵培养基中合成的 SN06 最多 ,抑菌圈直径可 达 35153 mm。以淀粉为碳源的发酵培养基中合 成的 SN06 次 之 , 其 抑 菌 圈 直 径 为 31196 mm (图 1) 。由于实际生产中淀粉容易获得 ,且具有 成本低等特点 ,因此选用淀粉进行不同水平的均 匀设计试验 。