第6章 DNA重组和克隆
发生在DNA分子内或分子间的遗传信息重 新组合，称为遗传重组(recombination)或基因重 排，重组产物称为重组体DNA(recombinant DNA)。 真核生物基因重组的主要途径，是减数分 裂时同源染色体之间的交换。 细菌的基因组为单倍体，虽然不进行减数 分裂，也可通过多种形式进行遗传重组，如质 粒DNA插入宿主的染色体均是典型的1条 链在相同的位置被特异性的内切 酶切开。 (2) 交叉和连接 被切开的链交 叉，并与另一个分子的同源链连 接，分子弯曲形成Holliday连接。 (3) 拆分 水平方向的切割(WE 裂解)，由此产生的重组体制交 换了DNA的一个小片段，称补 丁重组体(patch recombinant heteroduplex)。垂直方向的切割 (NS裂解)，由此产生的重组体有 一条链由两个DNA分子的链拼 接而成，称拼接重组体(splice recombinant heteroduplex)。
6.1.1.2 单链断裂模型(the singlestranded break model)， 单链断裂模型认为，在同源 区时，只有供体分子产生一个单 链切口，形成DNA单链，并入侵 受体DNA分子，形成Holliday结 构。其后进行的交叉点移动，和 Holliday结构的拆分，与Holliday 模型相同。单链断裂模型能很好 的解释细菌的接合作用和转化等 原核生物的同源重组，以及DNA 损伤的重组修复。
6.1.2 细菌的基因转移与重组
6.1.2.1 细菌的接合作用(conjugation)
细菌的细胞相互接触时，遗传信息可在接 合质粒的参与下，由一个细胞转移到另一细胞， 称为接合作用。
能够促使染色体基因转移 的接合质粒称为致育因子 (fertility factor)，简称性因子
6.1 同源重组
同源重组(homologous recombination)发生在同源 DNA片段之间，是在两个DNA分子的同源序列之间 直接进行交换的一种重组形式。不同来源或不同位 点的DNA，只要二者之间存在同源区段，都可以进 行同源重组。由于其广泛存在，亦称一般性重组 (general recombination)。 细菌的接合(conjugation)、转化(transformation) 和转导（transduction)，以及真核细胞减数分裂时同 源染色体之间发生的交换等都属于同源重组。
DNA重组对生物进化，物种多样性和种群
内的遗传多样性起着关键的作用。 基因突变: 有利突变，有害突变 生物如何积累有利突变，淘汰有害突变？ DNA重组能迅速增加群体的遗传多样性 (diversity)，通过优化组合(optimization)积累有利 突变，推动生物进化。
用人工操作构建DNA重组体，将其导入 受体细胞扩增或表达，称DNA克隆或分子克隆 (molecular cloning)，也可称作重组DNA技术， 或基因工程。 基因工程技术制造生物制品。 定向改变生物的遗传特性，使生物体获得 某些优良性状。转基因食品安全? 基因治疗, 安全性?
6.1.1.3 双链断裂模型 双链断裂模型(the double-stranded break model, DSB) 认为，受体双链(recipient duplex)两条链的断裂 启动了链的交换，不产生断裂的被称为供体双链 (donor duplex)。随后发生的DNA修复合成以及切口 连接导致形成两个Holliday连接。 DNA受到的双链断裂损伤，可以通过同源重组 来修复，在修复损伤的同时，进行基因重组。 真核生物的细胞减数分裂时的同源重组，符合 双链断裂模型。
接 重 组 体
5´ 片 3´ 段 重 组 5´ 体 3´
5´
5´
3´
目录
Potter和Dressler在电镜下看到的Holliday 中间体的结构(图6-2)，是对Holliday模型强有 力的支持。
尽管Holliday模型能解释重组的许多特征， 但也有某些不足。其一，DNA重组时，通常有一 个分子是供体，另一个是受体，而Holliday模型 无法区分供体和受体。其二，Holliday模型需要 两个DNA分子各有一条链在同一位置被切割，目 前尚未发现完成这一过程的确切机制。
(1) 内切酶切开受体双链DNA分子同源 区的两条链，启动重组过程(图6-3a) 。 (2) 在外切酶的作用下，双链切口扩大， 产生两个具有3'-末端的单链区，并形成一个 缺口(图6-3b)。 (3) 一个自由的3'-端入侵供体双链DNA 分子的同源区，形成异源双链，供体双链的 一条链被取代，产生取代环(a displacement loop, D环, 图6-3c)。 (4) 人侵的3‘-端引发以被人侵DNA链为 模板的DNA合成，导致D环扩大。以D环的 单链为模板，填补受体链上的缺口(图6-3d)。 (5) DNA连接酶连接切口，形成两个 Holliday连接，即联结体x和联结体y(图6-3e)。 (6) Holliday连接的拆分有4种可能。
5´ 3´ 3´ 5´
Holiday中间体
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
3´ 5´
5´ 3´
3´ 5´
内切酶 (ruvC)
3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´ 5´
内切酶 (ruvC)
5´ 3´
3´
5´
5´ 3´
5´ 拼
5´
3´
DNA 连接酶
3´
DNA 连接酶 3´
3´
5´
5´3´ 3´
6.1.1 同源重组的分子模型 6.1.1.1 Holliday模型 Holliday模型由美国科学家Holliday于1964年提 出。 (1) 切割 2条同源DNA各有1条链在相同的位置 被特异性的内切酶切开。 (2) 交叉和连接 被切开的链交叉，并与另一个 分子的同源链连接，分子弯曲形成Holliday连接。 (3) 拆分，产生重组体 补丁重组体(patch recombinant heteroduplex)。 拼接重组体(splice recombinant heteroduplex)