1
3 结果与分析
3.1质粒提取
用醋酸铵法提取pET-28a和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否
提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3
提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a提取成功。

3.2双酶切
用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3
的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳
道为pET-28a的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。

3.3 抗性筛选
通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP转入DH5α感

图 1 pET-28a和pEGFP-N3质粒提取电泳图
1、2泳道为pET-28a电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果

图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a
1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物
3号泳道为pEGFP-N3原始质粒
4号泳道为pET-28a酶切产物
5号用泳道为pET-28a原使质粒
2

受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有
抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板
长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中
不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。
失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致
培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃
上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。

3.4PCR鉴定
经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图
四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基
因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。

1号图为不含卡那的阴性对照
2号图为含卡那的阴性对照
3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照
4号图为含卡那的连接产物结果

图 3重组质粒转化DH5α感受态细胞

图 4阳性重组菌的PCR鉴定
1、2号泳道为重组质粒转化结果
3

3.5重组质粒提取
用醋酸铵法提取pET-28a-GFP后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，重组质粒是否
提取成功。得到电泳结果，如图五所示，1、2号泳道均有明显条带，说明重组质
粒提取成功。

图 5 pET-28a-GFP质粒提取
3.6重组质粒酶切鉴定
用BamH1和Xho1对重组质粒进行双酶切验证。1、2号泳道重组质粒的酶切结
果，如图六所示，电泳得到两条带，750bp左右的为GFP和5300bp左右的为PET-28a
说明质粒重组成功。

1、2号泳道为重组质粒转化结果

图 6 BamH1、Xho1对双酶切验证重组质粒
1、2号泳道为重组质粒电泳结果
4

3.7绿色荧光蛋白表达与观察
图 7重组质粒转化BL-21感受态细胞
结果如上图所示，一号板生长较多菌落，说明BL-21感受态细胞存活。二号
板也生长出菌落，有可能是因为发生突变。三号板中生长出较多菌落，证明卡那
有效。在四号平板中，经过IPTG的诱导，大部分菌落成功发出荧光，说明GFP基
因在大肠杆菌中成功表达。

1 2
3 4

一号板为平板中不含卡那的阴性对照 二号板为含卡那的阴性对照
三号板为含卡那的阳性对照 四号板为平板中含有卡那及IPTG的实验结果。
5

参考文献
[1]J. Sambrook, E. P Fritsch, T. Maaniatis, MolecuLar cloning A laboratory
Manual
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
[2]L戴维斯等编著，姚志建等译，《分子生物学实验技术》,34-36，科学出版
社,1990
[3]贺竹梅，刘秋云，一种提取质粒DNA的改良方法，生物技术6(1),37
38,1996
[4]王重庆等编著，《高级生物化学实验教程》，北京大学出版社,95
107,1994
[5]郝福英，朱玉贤等编《基础分子生物学实验》，北京大学出版社,2010
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致 谢
感谢老师的专业指导，感谢同组同学的帮助。