例如，既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。 这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因；还有真 核生物的自主复制序列及选择标记性状；具有多克隆位点。
通常穿梭载体：在细菌中用于克隆（扩增克隆的基因）， 在酵母菌中用于基因表达分析。
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表达载体用于外源DNA的表达
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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2.噬菌体(phage) 能感染细菌的病毒
（1）λ噬菌体DNA改造系统 线性双链DNA分子
cos位点:两端各有一条由12个碱基组成、彼此完全互补且5’突出的序 列
插入型：λgt系列，适用于cDNA克隆
置换型：EMBL系列，适用于4基850因0b组pDNA克隆
cos
12bp
12bp
cos
Long (left) arm Nonessential portion Short (right) for replication arm
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T-载体：
pMD18-T 2692bp
T7
HindIII Spln PstI HincII AccI SalI
T
T
Xbal BamHI SmaI XmaI KpnI SacI EcoRI
Sp6 LOGO
克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（二）常用克隆载体的种类
（2）M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）单链闭合w环ww状.theDmeNgallAery分.com子LOGO
克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（二）常用克隆载体的种类
3.穿梭载体(shuttle vector) 可在不同宿主细胞中应用
人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNA序列在不同种 类宿主细胞中复制、扩增。
一、目的DNA的分离获取（分） 分离获取目的DNA有多种方法：
(一) PCR——待扩增目的基因两直接合成目的DNA（序列已DNA 一个细胞只接受一个
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二、载体的选择与准备（择）；
（一）根据DNA克隆的目的选择与准备适宜载体
1. 获得目的DNA片段——选用克隆载体； 2. 获得目的DNA片段所编码的蛋白质——选用表达载体。
（二）考虑目的DNA的大小及受体细胞的种类和来源
载体 质粒
插入DNA片段
宿主细胞
cloning sites，MCS） 4.应有较高的拷贝数
pBR322质粒图谱
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克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（二）常用克隆载体的种类
1.质粒(plasmid)是最常用的克隆载体
广泛存在于细菌、酵母等多种微生物中 独立于宿主细胞染色体外的环状双链的超螺旋结构 能在宿主细胞内独立自主复制 带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状 质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。
重组DNA分子
单克）： 包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克 隆群体，以DNA片段的形式贮存了、目的DNA与载体连接（接）
T4DNA ligase
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表达载体（expression vector）：用来在宿主细胞 中表达外源基因的载体 依据其宿主细胞的不同可分为:
原核表达载体（prokaryotic expression vector） 真核表达载体（eukaryotic expression vector）
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PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L
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二、载体的选择与准备（择）；
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目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，可容纳 10kb以内的外源DNA 。
pUC18/19质粒图谱
pUC18/19质粒，2686bp，是最常用的质粒载体
缺乏控制拷贝数的rop基因，因此其拷贝数达500-700
载体（vector）：携带外源DNA，实现外源DNA在受体细 胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。
分类：
1.按功能
克隆载体（cloning vector） 表达载体（expression vector）
2.按基本元件 的来源
质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等
<5~10 kb
细菌，酵母
λ 噬菌体载体 ~ 20 kb
黏粒
~50ห้องสมุดไป่ตู้kb
细菌 细菌
BAC
~400 kb
细菌
YAC
~3Mb
酵母
（三）含有合适的MCS
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克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖
（一）克隆载体（cloning vector）应具备的主要特点
1.至少有一个复制起点（origin of replication, ori） 2.至少有一个选择性标志（selection marker） 3.有适宜的限制性内切酶的单一切点：多克隆位点（multiple