浙江省水稻品种DNA指纹数据库的初步构建及其应用程本义1吴伟2*夏俊辉1刘鑫2庄杰云1杨仕华1(1中国水稻研究所，浙江杭州310006；2浙江省种子总站，浙江杭州310020；*通讯联系人，E-mail:wuwei1610@)摘要：利用前期研究建立的一套水稻品种DNA指纹检测技术体系，对2002-2006年浙江省主要的水稻品种98个、2007-2008年省区试水稻品种155个（181个次，含26个续试品种）进行了DNA 指纹检测，构建了279个次水稻品种×12个微卫星标记的DNA指纹图谱数据库。
系统分析了指纹库中各标记的多态性和品种的相似性。
基于构建的指纹数据库，对所有品种的特异性及区试续试品种年度间的一致性进行了鉴定。
关键词：水稻品种；微卫星标记；DNA指纹库；特异性Construction and Application of DNA Fingerprint Database of Rice Varieties in Zhejiang ProvinceCHENG Ben-yi1,WU Wei2,*,XIA Junhui1,LIU Xin2,ZHUANG Jie-yun1,YANG Shi-hua1(1China National Rice Research Institute,Hangzhou310006,China;2Zhejiang Provincial Seed Management Station,Hangzhou310020,China;*Corresponding author,E-mail:wuwei1610@)Abstract:A total of98major rice varieties in Zhejiang province from2002to2006 and155rice varieties in Zhejiang provincial regional trial from2007to2008were assayed with a set DNA fingerprint testing system on rice variety.A DNA fingerprint database containing genotypic data of279rice variety times at the12marker loci was constructed.The polymorphism of different markers and genetic similarity of varieties in the DNA fingerprint database were analyzed.Based on the DNA fingerprint database,the distinctness of all rice varieties and consistency of the same varieties in different years were identified.Key words:rice variety;microsatellite marker;DNA fingerprint database; distinctness特异性（Distinctness）是农作物新品种权申请和品种审（认）定的前提条件。
“九五”中后期以来，在种子产业快速发展的推动下，浙江省包括水稻在内的农作物品种数量明显增加，在促进农业生产发展的同时，也不同程度存在品种雷同、侵权等现象。
而目前，水稻品种特异性鉴定的主要方法是新品种DUS测试，该方法测试周期长、工作量大，难以及时高效地对浙江省大量水稻品种进行特异性鉴定，有必要寻求一种快速、准确、高效的新方法。
二十世纪九十年代以来，随着分子生物学的发展，以分子标记为基础的DNA指纹基金项目：浙江省“三农五方”科技协作项目（Sn200606）；中央级公益性科研院所专项资金项目（2006RG002）。
作者简介：程本义（1977-），男，浙江淳安人，助理研究员，主要从事水稻新品种评价和品种DNA指纹鉴定研究。
E-mail：cby_951019@。
技术日趋成熟，并逐渐应用于农作物品种鉴定领域。
在利用DNA指纹技术进行农作物品种鉴定时，若只针对少数特定品种，则可以同时鉴定，如少数品种的纯度、真假鉴定等[1-5]；若要进行品种特异性鉴定，则需要建立已知品种的DNA指纹数据库。
近年来，国内外主要农作物品种DNA指纹数据库的构建工作已逐步展开，如Röder[6]等用20个DNA微卫星标记构建了欧洲500多个小麦品种的指纹数据库；Bredemeijer[7]等用20个微卫星标记构建了欧洲500多个番茄品种的DNA指纹数据库；赵久然、王凤格[8-10]等进行了中国玉米新品种DNA指纹库构建的系列研究，旨在从DNA分子水平上给每个玉米品种一个身份证；庄杰云[11]等初步构建了我国主栽水稻品种的微卫星标记数据库。
本研究利用前期建立的一套水稻品种DNA指纹检测技术体系，对浙江省近期的主要水稻品种及2007-2008年参加省区试的水稻品种进行DNA指纹检测，建立了包含253个(279个次，含26个续试品种）水稻品种的DNA指纹图谱数据库。
并基于该指纹图谱数据库，对所有品种的特异性及区试续试品种年度间的一致性进行鉴定，为进一步规范和完善浙江省水稻品种区试、审定及管理工作提供技术支持。
1材料与方法1.1水稻材料依据浙江省农作物品种审定公告、农作物分品种推广面积统计等资料，征集2002-2006年通过浙江省审定、引种审批和国家审定适宜在浙江省推广种植以及2002年前通过审定且目前生产上仍有较大种植面积的水稻品种98个；依据浙江省水稻品种区域试验实施方案，收集2007-2008年参加省区试的水稻品种155个（181个次，含26个续试品种）。
本研究共收集到目标水稻品种253个（279个次，含26个续试品种），其中常规籼型43个、粳型55个，杂交籼型124个、粳型31个。
1.2指纹检测选取24个水稻DNA微卫星标记，每条染色体上2个，按推荐类型可分为首选标记12个，分别是RM297、RM71、RM85、RM5414、RM274、RM190、RM336、RM337、RM219、RM311、RM209和RM17；候补标记12个，分别是RM1195、RM208、RM232、RM273、RM267、RM253、RM18、RM72、RM278、RM258、RM224和RM19。
这些标记的基因组位置、引物序列、多态性片段大小等相关信息见文献[11]。
遵照前文[12]所述方法提取水稻品种的总DNA、进行PCR扩增、电泳分离扩增产物、记录指纹（带型）。
利用12个首选标记对所有水稻品种进行指纹检测，对12个首选标记座位上指纹表现一致的水稻品种进一步增加12个候补标记检测。
1.3数据分析以多态性频率（frequency of polymorphism，FP）描述微卫星标记的多态性，该参数表示微卫星标记在水稻品种间检测到差异性的频率。
其计算公式为：式中，n 为所分析的微卫星标记在水稻品种中检测到的不同带型总数，m 为水稻品种总数，m i 为具有第i 种带型的品种数。
同时，应用软件NTSYS [13]、以共有DNA 片断比例[14]（软件中参数为DICE）为指标计算各对水稻品种间的遗传相似系数，并按类型分析品种的相似性。
2结果与分析2.1DNA 指纹数据库的初步构建为了保证指纹检测的效果，所有品种的检测操作均由同一人完成、实验试剂均由同一厂商提供。
对于每个首选标记，按固定品种顺序，将所有279个次水稻品种的PCR 扩增产物上样于9块凝胶、电泳分离、银染显色，共计检测图版108个。
在胶版排列上，每块凝胶的最左侧泳道设置100bp DNA 分子量Marker，中间泳道设置带型标准对照（CK），两边泳道上样相同数目的待测品种，图1所示为35个水稻品种在RM336标记座位上的指纹表现。
在前期研究结果[15]中，按照带型清晰、稳定重现的原则，12个首选标记共认定了nFP =1-∑[m i ×(m i -1)]/[m ×(m-1)]i图1、35个品种在RM336标记座位上的指纹表现Fig.1Fingerprint performance of 35rice varieties at marker locus RM336.71个等位基因，并依据多态性片段分子量从大到小按1、2、3、4、5…对所有等位基因进行了编号。
在本研究的指纹检测过程中，有3个标记检测到新的多态性片段，分别是RM71在丰优香占和浙优9号品种中检测到1个（编号3），RM209在甬优2号和甬优4号品种中检测到1个（编号3），RM17在浙粳40、浙粳20、浙糯5号和航天36品种中检测到1个（编号5）。
最后，以认定的74个等位基因为基础记录所有品种的带型，并对带型数据进行整理，建立了279个次水稻品种×12个微卫星标记的DNA指纹图谱数据库。
表1为4个代表性水稻品种在12个首选标记座位上的指纹数据。
表14个代表性水稻品种在12个微卫星标记座位上的指纹数据Table1Fingerprint data of4representative rice varieties at12SSR loci.标记Marker 等位基因Allele浙101Zhe101浙粳40Zhejing40丰优香占Fengyouxiangzhan甬优2号Yongyou2标记Marker等位基因Allele浙101Zhe101浙粳40Zhejing40丰优香占Fengyouxiangzhan甬优2号Yongyou2RM29710000RM27411010 200002011130101RM337100004000021010500003010160000400007101050000 RM7110000RM21910000 2000020000 3*001030010400004000050001510006111160101 RM851101070000 2000080001300009000040101100000 RM541410000RM31110010 20111200003000030000410104000150001510106000060101 RM1901111170000 200008000031000RM209100004000020000 RM336100003*0001 2001041010300005011140000RM171000050000210106000030000 7000040000 810005*0100 9010160001 10000070000注：*表示本研究中新发现的等位基因。