铁线莲属植物叶绿体微卫星引物开发及其遗传分析陈文超;苏琬涵;刘志高;季梦成【摘要】The whole chloroplast genome sequence of Clematis fuscavar.coreana from GeneBank database was ana-lyzed, and 11 cpSSR primer pairs were designed based on that .In addition, the transferability of the 11 pairs of cpSSR primer in different species and cultivars of Clematis were studied .The results showed that 67 cpSSRs were distributed across the whole chloroplast genome , and most of them located in the area 1088-41445 bp and 50135-127217 bp, which generally consisted of a single base A/T.All of the 11 pairs of cpSSR primer could be successful-ly cross-amplified in different species and cultivars of Clematis, which indicated that the 11 primer pairs for cpSSR markers had good transferability in Clematis.The average number of alleles (Na) was 10.91, effective number of al-leles (Ne) was 5.40, major allele frequency (MAF) was 0.31, and polymorphism information content (PIC) was 0.79 .In addition , clustering result of UPGMA of 55 samples based on cpSSR data was discussed .%对GeneBank数据库中Clematis fusca var.coreana叶绿体全基因组进行了分析,以此为基础设计出11对叶绿体SSR引物,并进一步研究了11对叶绿体SSR引物在铁线莲属其他野生种类和栽培品种中的通用性.结果表明,C.fusca var.coreana叶绿体基因组内共有67个SSR位点,主要分布于1088~41445 bp和50135~127217 bp,以A/T单碱基重复为主;设计所得11对cpSSR引物在铁线莲野生种类和栽培品种中均表现出良好的通用性,在55个铁线莲样本中扩增等位基因数(Na)平均为10.91,有效等位基因数(Ne)平均为5.40,主等位基因频率(MAF)平均为0.31,多态信息含量(PIC)平均为0.79.另外,基于cpSSR数据,对55个样本的UPGMA聚类结果进行了初步讨论.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2017(029)012【总页数】9页(P2023-2031)【关键词】铁线莲属;叶绿体微卫星;引物开发;等位基因【作者】陈文超;苏琬涵;刘志高;季梦成【作者单位】浙江农林大学风景园林与建筑学院,浙江临安 311300;浙江农林大学风景园林与建筑学院,浙江临安 311300;浙江农林大学风景园林与建筑学院,浙江临安 311300;浙江农林大学风景园林与建筑学院,浙江临安 311300【正文语种】中文【中图分类】S567.23+9叶绿体基因组通常为母性遗传，基因变异概率低且进化速率缓慢，因而被广泛应用于植物分类及系统进化分析[1-2]。
叶绿体微卫星(Chloroplast simple sequence repeat，cpSSR)在基因组中出现的频率较高[3-4]，与核SSR(Simple sequence repeat)相比，既具有共显性遗传、多态性丰富的特点，又保持了叶绿体基因组的单亲遗传模式，几乎不发生重组，在遗传多样性、群体遗传结构、亲缘地理学和杂种鉴定方面被广泛应用，是一种高效的分子标记技术。
铁线莲属(Clematis)是毛茛科中包含种类最多的一属，分布于北温带[5]，世界范围内约有铁线莲属植物300余种[6-7]，多为木质藤本。
本属植物花型、花色多样，观赏栽培品种丰富，被誉为藤本皇后，深受家庭园艺爱好者的喜爱。
铁线莲属植物含有类黄酮、三萜皂苷等化学成分，具有很高的药用研究价值。
有关该属植物分类和系统进化方面的研究已取得许多重要结果[8-10]，但属内仍有多个组别的铁线莲分类学地位并未明确[11-13]。
目前，已有多种分子标记方法用于铁线莲属植物系统进化及遗传多样性研究。
Gardner等[14]利用ISSR标记对32个藤本铁线莲品种和5个直立型品种的亲缘关系进行了分析；RAPD标记被用于鉴定铁线莲杂交种[15]；atpB-rbcL spacer region、matK、trnK、trnL intron、trnL-trnF spacer region等叶绿体基因组序列被应用于铁线莲属种间遗传多样性分析[16-17]，蒋明等[18]和李骁等[19]对共计14种药用铁线莲属植物的ITS序列进行了分析，并构建了系统发育树。
但有关铁线莲属植物叶绿体SSR标记的开发与应用尚未见报道。
本研究在GeneBank数据库中搜索到Clematis fusca var. coreana 的叶绿体全基因序列，以此为基础进行cpSSR引物开发，并用于铁线莲野生种和栽培种之间遗传信息的检测，筛选出的cpSSR引物可作为本属植物系统发育、群体遗传结构等遗传信息检测和研究的有效工具。
以种植在浙江农林大学铁线莲种质资源圃的15个进口铁线莲栽培品种和11个国产野生种为研究对象。
除单一样本的野生种类外(安徽铁线莲、圆锥铁线莲、大花威灵仙和天台铁线莲野生资源稀少，种质资源圃目前仅各保留了1株)，相同野生种类的不同单株均来自于同一居群，栽培品种种苗购自波兰óączy公司。
以健康的新叶为试材，其中，野生种类46个单株，分别取样；每个栽培品种3个单株，取混合叶样，共计61个样本作为试验材料(表1)。
叶片经液氮速冻后带回实验室，-80 ℃保存备用。
1.2.1 cpSSR位点搜寻与引物开发从GeneBank数据库(http: ///entrez)下载C. fusca var. coreana的叶绿体全基因组序列(GenBank No. KM652489.1)，用Misa软件分析其SSR位点信息，参数设置：单碱基、二碱基和三碱基重复微卫星最小重复次数分别为10、6和4，四碱基和四碱基以上微卫星最小重复次数为3。
使用微软Windows 7系统的记事本和Excel 2007软件打开Misa软件的分析结果文件*.statistics和*.misa，查看和统计C. fusca var. coreana叶绿体基因组序列全长、SSR位点数量和具体分布位置、不同类型SSR占比等信息。
利用Primer Premier 5软件，按照引物长度20～25 bp，PCR产物100～300 bp，退火温度50～65 ℃，正、反向引物退火温度之差在5 ℃以内，GC含量30%～60%设计引物，尽量避免引物出现二级结构。
1.2.2 DNA提取、PCR扩增与产物检测使用E.Z.N.A Plant DNA Mini Kit Spin Protocol (Omega Bio-tek)试剂盒提取叶片基因组DNA。
PCR总反应体系为20 μL:ddH2O 11 μL，10× buffer 2 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.4 μL，Dynazyme II DNA polymerase 0.6 μL，DNA(约20 ng)2 μL，引物各2 μL。
PCR反应程序：94 ℃ 45 s；94 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 5 min。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步检测后，使用Qsep100毛细管电泳(中国台湾产)测定产物片段大小。
1.2.3 数据分析使用Powermarker V3.25和Popgene 3.2软件统计主等位基因频率、等位基因数、有效等位基因数、多态信息含量等信息，并依据Nei’s遗传距离，采用UPGMA法构建系统进化树[20]。
C. fusca var. coreana的叶绿体基因组全序列长度为159 609 bp，从1 088 bp到158 278 bp共分布有67个SSR位点。
经统计，SSR位点序列总长度777 bp，为叶绿体基因组长度的0.5%；其中，单碱基重复微卫星50个，占比74.63%，A 和T是主要重复单元，分别占38.0%和60.0%，G仅出现1次，C没有出现；二至四碱基微卫星包括14种基元，二碱基微卫星共3个(占4.5%)，所含基元仅TA一种；三碱基微卫星共4个(占6.0%)，含有4种基元；四碱基微卫星共10个(占14.9%)，含9种基元，其中ATAA出现了2次，占微卫星总数的3.0%(表2)。
cpSSR在整个叶绿体基因组中分布并不均匀，在1 088～41 445 bp(占总长度25.3%)和50 125～127 217 bp(占总长度48.3%)区域相对密集，分别有27(占40.3%)和38(占56.7%)个微卫星。
而在起始区域1～1 087 bp没有SSR位点分布，末尾区域157 054～159 609 bp仅有2个SSR位点。
使用Primer Premier 5对随机挑选的5个单碱基重复微卫星[A]11、[A]14、[G]10、[T]10、[T]13及二碱基及以上重复的17个微卫星位点进行引物设计。
共筛选获得11对引物，具体信息见表3。
引物在11种野生铁线莲的46个样本和9个栽培品种的9个样本中，共得到120条产物带，毛细管检测结果清晰、明确(图1)。
各引物对在仙女座、倪欧碧、粉香槟、吉恩斯、面白和雪舞等6个栽培品种中均未能得到扩增产物，所得产物片段大小为191～303 bp。
由表4可知，得到有效扩增产物的55个样本(野生种和栽培品种)中：产物条带数7～18，平均10.91；有效条带数3.92～8.33，平均5.40；主等位基因频率0.22～0.44，平均0.31；多态信息含量0.72～0.88，平均0.79，其中，引物Clecp3多态信息含量最高，Clecp9最低(表4)。