黄色反应： （三）黄色反应：
苯酚溶液， 一、取一支试管加 4滴0.5%苯酚溶液，再加浓 滴 苯酚溶液 硝酸2滴 观察黄色出现，冷却后逐滴加入10%氢 硝酸 滴，观察黄色出现，冷却后逐滴加入 氢 氧化钠溶液，观察颜色转变为橙色。 氧化钠溶液，观察颜色转变为橙色。
滴及浓硝酸2滴 二、取一支试管加蛋白质溶液 4滴及浓硝酸 滴，由于强酸的作 滴及浓硝酸 开始蛋白质形成白色沉淀，小火加热，则沉淀变为黄色， 用，开始蛋白质形成白色沉淀，小火加热，则沉淀变为黄色， 冷却之，逐滴加入10%氢氧化钠溶液，颜色由黄色转变成深 氢氧化钠溶液， 冷却之，逐滴加入 氢氧化钠溶液 橙黄色。 橙黄色。 剪少许指甲或头发放入试管中，加入数滴浓硝酸， 三、剪少许指甲或头发放入试管中，加入数滴浓硝酸，观察颜 色变化。 色变化。
HO
NO + H2O 2
OH HO NO + Na 2 OH O N OH
(四)坂口反应 (Sakaguchi reaction)
在次溴酸钠或次氯酸钠存在的条件下， 在次溴酸钠或次氯酸钠存在的条件下，许多含有胍基的化合物 (如 如 胍乙酸、甲胍、胍基丁胺等 能与 萘酚发生反应生成红色物质。 能与α-萘酚发生反应生成红色物质 胍乙酸、甲胍、胍基丁胺等)能与 萘酚发生反应生成红色物质。在20种 种 氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所以只有它呈正反应。 氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所以只有它呈正反应。 生成的氨被次溴酸钠氧化生成氮。该反应中过量的次溴酸钠是不利的， 生成的氨被次溴酸钠氧化生成氮。该反应中过量的次溴酸钠是不利的， 因其能进一步缓慢氧化，使产物破裂分解，引起颜色消失。但加入适量 因其能进一步缓慢氧化，使产物破裂分解，引起颜色消失。 尿素可破坏过量的次溴酸钠。酪氨酸、 尿素可破坏过量的次溴酸钠。酪氨酸、色氨酸和组氨酸也能降低产生颜 色的强度。甚至会阻止颜色的生成。 色的强度。甚至会阻止颜色的生成。 该反应灵敏度达 1：250 000。因此常用于定量测定精氨酸的含量和定性 ： 。 鉴定含有精氨酸的蛋白质。 鉴定含有精氨酸的蛋白质。 。
㈤乙醛酸反应
向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸 (常 含有少量乙醛酸或醛类)约1mL并混匀倾斜试 管，谨慎地沿着管壁加浓硫酸(AR)约1mL， 使其重迭，且勿使二者混合。静置后，观察 在两液界面上出现的红紫色环，于水浴中微 热，可加快色环形成。 用20%的白明胶作乙醛酸反应。观察结果。
思考题：
实验材料
试剂 （一）试剂
1、 卵清蛋白溶液 2、10% 氢氧化钠溶液 、 、 3、1% 硫酸铜溶液 4、尿素 、 、 5、0.5%甘氨酸溶液 6、 0.1%茚三酮水溶液 、 、 7、0.1%茚三酮乙醇溶液 茚三酮乙醇溶液 、 8、0.5%苯酚溶液 苯酚溶液 9、浓硝酸 、 、 10、0.3%色氨酸溶液 、 12、考马斯亮蓝染液 、 11、0.3%酪氨酸溶液 、 13、大豆提取液 、
(四)坂口反应 支试管， 取 2支试管，分别加入 支试管 分别加入1mL 0.3%精氨酸溶液和蛋 精氨酸溶液和蛋 白溶液，各加20%氢氧化钠溶液 滴，1%α-萘酚 氢氧化钠溶液5滴 白溶液，各加 氢氧化钠溶液 萘酚 酒精溶液2滴 次溴酸钠溶液 滴 摇匀， 酒精溶液 滴，次溴酸钠溶液6滴，摇匀，放置片 观察出现的颜色。 刻，观察出现的颜色。
OH + OH R
H C NH 2 COOH
H + OH RC H O + NH 3 + CO 2
蓝紫色复合物
黄色反应(Xanthoproteic reaction) （三）黄色反应
该化合物在碱性溶液中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠 .
含
凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用产生黄色的硝基苯衍生物。 凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用产生黄色的硝基苯衍生物。
器材 （二）器材
1、试管及试管架 、 4、量筒 、量筒 2、水浴锅 3、酒精灯（或电热套） 、水浴锅 、酒精灯（或电热套） 5、滤纸片 6、滴管 、滴管 、
实验操作
双缩脲反应： （一）双缩脲反应：
取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火加热使尿素熔化。 一、取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火加热使尿素熔化。熔化的 尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后， 尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后，加 10%NaOH溶液约 10%NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加入1%CuSO ４ 溶液1滴，振荡之。 溶液约1mL，振荡混匀，再加入1%CuSO 溶液1滴 振荡之。 观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜， 观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖 粉红色。 粉红色。 取另一支试管， 卵清蛋白溶液和10%氢氧化钠溶液 氢氧化钠溶液2mL，摇匀， 二、取另一支试管，加 1mL卵清蛋白溶液和 卵清蛋白溶液和 氢氧化钠溶液 ，摇匀， 再加1%硫酸铜溶液两滴，随加随摇，观察紫玫瑰色的出现。 再加 硫酸铜溶液两滴，随加随摇，观察紫玫瑰色的出现。 硫酸铜溶液两滴
在蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基易发生上述反应， 在蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基易发生上述反应，而苯丙氨酸不易硝 需加少量浓硫酸催化才能呈明显的正反应。皮肤、指甲、 化，需加少量浓硫酸催化才能呈明显的正反应。皮肤、指甲、头发等遇 浓硝酸变黄即为这一反应的结果。 浓硝酸变黄即为这一反应的结果。
OH + HNO 3
1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反 如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反 应呈阴性结果， 应呈阴性结果，此时可对水解程度作出什么 结论? 结论 2.能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存 能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存 在? 3.白明胶对乙醛酸反应呈阴性，为什么? 白明胶对乙醛酸反应呈阴性，为什么 白明胶对乙醛酸反应呈阴性
茚三酮反应： （二）茚三酮反应：
支试管分别加入蛋白质溶液和0.5%甘氨酸溶液 甘氨酸溶液1mL，再加 一、取 2支试管分别加入蛋白质溶液和 支试管分别加入蛋白质溶液和 甘氨酸溶液 ，再加0.5mL 0.1%茚三酮水溶液混匀，在沸水浴中加热 ～2min，观察颜色由粉色变 茚三酮水溶液混匀，在沸水浴中加热1～ 茚三酮水溶液混匀 ， 成紫红色再变蓝。 成紫红色再变蓝。 二 、 在一小片滤纸上滴上一滴 0.5%的甘氨酸溶液， 风干后，再在原处滴 的甘氨酸溶液， 风干后， 的甘氨酸溶液 0.1%的茚三酮乙醇溶液一滴，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出 的茚三酮乙醇溶液一滴，在微火旁烘干显色， 的茚三酮乙醇溶液一滴 现 。
实验五
蛋白质及氨基酸的呈色反应
一
实验目的
1、了解构成蛋白质的基本结构单位和主要连接方式。 、了解构成蛋白质的基本结构单位和主要连接方式。 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
㈤乙醛酸反应 (Adamkiewica-HopkinsCole reaction)
在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生 成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一 分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与 靛蓝相似的物质。 色氨酸在浓硫酸中与一些醛类反应也形成 有色物质。很多人用含有少量醛杂质的冰醋 酸或芳香醛等进行此反应。硝酸根、亚硝酸 根、氯酸根及过多的氯离子均能妨碍此反应， 有微量硫酸铜或 Fe ３＋ 离子存在时，可以 加强色氨酸的阳性反应。
茚三酮反应(Ninhydrin reaction) (二) 茚三酮反应
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的α氨基酸 及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行， 及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行，首 先是氨基酸被氧化， 和醛 先是氨基酸被氧化，产生 CO ２ 、NH 3 和醛，而水合茚三酮被还原成还原 型茚三酮； 型茚三酮；第二步是所生成之还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨 缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为5～7，同一浓度的蛋白质或氨基酸 缩合生成有色物质。此反应的适宜 为 ～ ， 在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 在不同 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。该反应十分灵 条件下的颜色深浅不同 浓度的氨基酸水溶液即能显示反应， 敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，因此是一种常用的氨 ： 浓度的氨基酸水溶液即能显示反应 基酸定量方法。但也有些物质对茚三酮也呈类似的阳性反应， 丙氨酸、 基酸定量方法。但也有些物质对茚三酮也呈类似的阳性反应，如β-丙氨酸、 丙氨酸 氨和许多一级胺化合物等。所以定性或定量测定中，应严防干扰物存在。 氨和许多一级胺化合物等。所以定性或定量测定中，应严防干扰物存在。
茚三酮反应分为两步， 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形 和醛， 成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚 三酮；第二步是所形成的还原性茚三酮同另一个水 三酮； 合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
O C C C O O C C C O
O C C C O O C C C O N C C O NH 2 O C + 2 H 2O OH H + C O O C C O + 2NH 3
实验原理
(一) 双缩脲反应(Biurea reaction)
所谓双缩脲反应是指在碱性条件下，双缩脲与二价铜离子作用， 所谓双缩脲反应是指在碱性条件下，双缩脲与二价铜离子作用，生成紫红色配合 物的反应。 180℃左右时 两分子尿素缩合脱去一分子氨，生成双缩脲。 左右时， 物的反应。当加热至 180℃左右时，两分子尿素缩合脱去一分子氨，生成双缩脲。在 肽和蛋白质分子中具有肽键，其结构与双缩脲类似，也能发生此反应， 肽和蛋白质分子中具有肽键，其结构与双缩脲类似，也能发生此反应，生成蓝紫色或 紫红色的配合物。该反应常用于蛋白质的定性或定量测定。应当指出， 紫红色的配合物。该反应常用于蛋白质的定性或定量测定。应当指出，该反应的干扰 因素较多，一些含有一个肽键和一个-CONH 因素较多，一些含有一个肽键和一个-CONH２、-CS-NH ２ 、-CH 2 -NH ２ 等基团 CS的物质也有双缩脲反应。并且NH 对此反应具有严重的干扰，因为NH 的物质也有双缩脲反应。并且NH ３ 对此反应具有严重的干扰，因为NH ３ 与铜离子 可生成深蓝色的铜氨配合物。因此我们可以说蛋白质和多肽都有双缩脲反应， 可生成深蓝色的铜氨配合物。因此我们可以说蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双 缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。此反应所产生颜色的深浅与蛋白质的浓度 成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。 成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。