生物化学实验（二）绪论▪随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断丰富，生物化学实验也在不断更新和提高。
▪本门课程在以往教学工作的基础上，结合生物化学实验教学，力求使学生能够更加深刻地学习生物化学课程。
本实验课实验项目覆盖了当今生物化学研究中常用的技术和方法。
绪论一、实验目的▪掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；▪掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能；▪培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。
▪二、通过生物化学实验应该做到▪学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。
▪训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。
▪学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。
▪掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。
▪三、实验室规则▪１、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静，不得喧哗吵闹、迟到早退。
▪２、爱护仪器，厉行节约。
试剂、药品、蒸馏水等应节约使用，不得浪费。
如不慎损坏仪器，应及时报告老师，说明原因；贵重、精密仪器，应先熟悉使用方法，在老师的指导下，严格按操作规程操作；发现故障，应立即报告老师，不得擅自处理。
仪器使用完毕后，一定要填写使用记录。
绪论▪３、取用试剂时，应仔细辨明标签，以免取错。
取完试剂后，应及时将瓶盖盖好，放回原处，切忌乱拿乱放。
▪４、注意安全。
对于有毒、腐蚀的试剂应避免其直接接触人体及衣物；乙醚、丙酮等易燃试剂应远离火源，以免发生意外。
▪５、注意实验室卫生、整洁。
废弃液体应倒入水槽，实验用过的和棉花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均应放入指定容器，不得随意乱扔。
实验结束后应将实验台整理好，并清扫、整理实验室。
关好水、电、门、窗，方可离开实验室。
绪论▪四、实验须知▪１、实验前应作好预习，认真阅读实验指导。
明确学习目标，能简述实验内容及主要的操作步骤。
▪２、实验过程中，应根据实验指导及老师的要求，认真操作，细心观察，如实记录。
严禁捏造实验数据，提倡实事求是的科学态度，杜绝弄虚作假。
▪３、实验结束后，将实验原始数据填写到实验报告册中的原始数据栏，并当场交给老师批阅。
回去后要认真书写实验报告，及时交老师批阅。
绪论—五实验记录与实验报告1、实验记录实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔)。
实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。
(直接填写到实验报告册的原始数据栏） 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。
所有数据都应如实记录，不得随意涂改。
实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。
杜绝一切抄袭和弄虚作假现象，一旦发现后果自负。
绪论—五实验记录与实验报告▪2、实验报告▪实验预习报告包括如下内容：①实验项目名称；②详细实验目的、原理；③实验操作步骤；④注意事项。
▪实验报告包括如下内容：①实验项目名称；②简写实验目的、原理；③实验结果；④分析与讨论；⑤注意事项等。
实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响▪一、目的▪了解激活剂和抑制剂对酶活力的影响，掌握淀粉酶活性鉴定的方法。
实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响▪二、原理▪酶的活性受某些物质的影响，有些物质能增加酶的活性，称为激活剂；而另一些物质则降低酶的活性，称为抑制剂。
▪Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。
而Cu+为抑制剂。
将淀粉与酶相混，作用一段时间后，淀粉被水解，遇碘不显蓝色，酶活力强，需时短，酶活力弱，需时长，故可用反应时间表示酶活力的强弱。
实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响▪四、实验器材▪1、0.1%淀粉液:称取可溶性淀粉0.1克,先用少量水加热调成糊状,再加热水稀释至100ml.▪2、1%的氯化钠溶液:1gNaCl溶于100ml 蒸馏水▪3、1%硫酸铜溶液:1gCuSo4溶于100ml 蒸馏水▪4、稀碘液：于2%碘化钾溶液中加入碘至淡黄色。
实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响▪五、操作▪取试管3支，按表1编号并加入试剂。
加毕，摇匀，同时置40℃水浴保温，每隔2min 取液体1滴置白瓷板上用碘液试之，哪支管液最先不呈现蓝色，哪支管次之，说明原因。
0.1%淀粉液/ml 1%的氯化钠溶液/ml 1%硫酸铜溶液/ml H2O/ml 1：30唾液/ml 1 2.0 1.0------ 1.02 2.0---- 1.0-- 1.03 2.0-------- 1.01.0管号试剂实验一激活剂和抑制剂对酶活力的影响▪六、实验注意事项▪1、实验过程中试剂取量一定要保证一致性，同时一定要认真观察实验现象，不能漏过实验颜色的变化点。
▪2、要正确找到反应终点，并记下相应反应时间。
▪3、要在预热2min后加入唾液，并在加入唾液后马上记时。
实验二、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定▪一、目的和要求▪1.了解并初步掌握吸附层析的原理。
▪2.学习薄层层析的一般操作及定性与定量鉴定的方法。
▪3.学习提取植物材料中可溶性糖的一般方法，并学会简易薄板的制作实验二、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定▪二、原理▪1、植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来，经除去杂质，即可获得较纯的可溶性糖混合物。
▪▪二、原理▪2、薄层层析是层析法的一种，层析法是利用被分离样品混合物中各组分的物理，化学差别，使各组分以不同程度分布在两个“相”中，这两个相通常使一个被固定在一定的支持物上的，称为固定相；另一个是移动的，称为流动相；▪当流动相流过固定相时，在移动过程中由于各组分在两相中的分配情况不同，或吸附性质不同，或电荷分布不同，或离子亲和力不同等，而以不同速度前进，从而达到分离的目的。
▪二、原理▪3、薄层层析是一种快速而微量的层析方法，它是将一种固定支持物均匀地涂在薄板上，对物质进行层析的方法。
▪本实验只讨论吸附薄层层析，即所有支持物是吸附剂（如硅胶粉），层析时，主要是根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，因此个组分的移动速度不同，从而达到分离混合物的目的。
▪二、原理▪4、糖为多羟基化合物，具有较强的极性，在硅胶G薄板上展层时，糖与硅胶分子有一定的吸附力。
▪硅胶分子与糖的吸附能力大小取决于糖的分子量和羟基数目，造成各种糖分子在展层过程中移动的距离不同，从而将各种糖分离出来。
▪一般吸附力的大小为：三糖>双糖>己糖>戊糖。
其中各种糖移动的速率可用Rf值表示。
通过与标准糖的Rf值比较。
即可鉴定出植物组织提取液中糖的种类。
实验二、、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定▪二、原理▪5、R f计算公式：▪溶质斑点中心到样点的距离▪R f(值)=溶剂前沿到点样点的距离▪▪三、实验材料、仪器和试剂▪1．材料：苹果或其他植物材料▪2．仪器：（1）离心机及离心管（2）天平（3）研钵（4）量筒25ml（5）移液管10ml（6）恒温水浴（7）毛细管（8）层析缸（9）吹风机（10）玻璃板：7×15cm（11）烘箱（12）喷雾器（13）烧杯50ml,100ml铅笔、尺子▪三、实验材料、仪器和试剂▪3．试剂▪（1）无水酒精▪（2）氯仿：冰醋酸：水，配比为30：35：5▪（3）1％标准糖溶液（10mg/ml）：木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖等。
▪（4）苯胺－二苯胺－磷酸显色剂：2克二苯胺，加2ml苯胺，10ml85％磷酸，1ml浓HCl，100ml 丙酮，溶后摇匀。
▪（5）0.1M硼酸溶液▪四、操作▪1.水果中可溶性糖提取液的制备▪1.1取洗净的苹果（或其他水果）削去果皮，称8g果肉在研钵中研成匀浆后，倒在四层洗净的纱布上。
包起臵于漏斗，用干净玻璃棒将果汁压出。
▪1.2取果汁2ml于离心管中，加无水乙醇6ml，充分混匀后，在3000转／分下离心20分钟，上清夜即为可溶性糖提取液。
实验二、、可溶性糖的薄层层析分离与定量鉴定▪四、操作▪2.苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定▪2.1点样取活化后的硅胶G板一块，距底边1.5厘米水平线上确定4个点，相互间隔1厘米，其中3个点，分别点上5％的木糖、葡萄糖、蔗糖标准溶液数滴，另一点点上苹果提取液数滴，一般点4次。
▪2.2展层以氯仿：冰醋酸：水展层剂上行展层，当展层前沿达距薄板顶端1.0厘米左右处，取出玻板用吹风机吹干。
▪2.3染色以苯胺－二苯胺－磷酸显色剂喷雾，于85℃烘箱中10分钟，各种糖即显示出不同色斑与标准糖比较，观察各点的颜色。
▪2.4计算根据斑点颜色及Rf值即可初步鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖的种类。
▪四、操作▪3．板的制备：▪3.1 玻璃板须表面平整、光滑、清洁。
用洗涤液浸泡，洗净，晾干，否则吸附剂容易剥落。
▪3.2 取硅胶G粉2克，加0.1M硼酸溶液4.5ml于研钵中充分研磨成糊状时，倾倒在薄板上，然后用手轻轻倾斜玻璃板，使糊状吸附剂在整块板上分布均匀，表面平坦光滑。
▪3.3 将制好的薄板臵于水平台上自然晾干后，用前于110℃烘箱中活化一小时使用。
▪五、实验注意事项▪1、薄板制备过程中，一定要保证玻璃板干净、干燥且无油渍▪2、薄板制备过程中，加硼酸搅拌及研磨一定要快，要研磨均匀，一般研磨到发出如脂肪光泽时，且要有一定的流动性，立即涂匀为最好▪3、铺好板后，要在水平台上自然晾干，用前于110℃烘箱中活化一小时（时间计算从达110℃开始），但活化时要在低温（60℃左右）时就将板放进烘箱，防止因骤然升温导致硅胶板脱落。
▪五、实验注意事项▪4、在用毛细管点样时，毛细管应垂直于硅胶G板的方向点样，而且毛细管接触G板的时间应尽量短，点样斑点直径一般不宜超过3mm。
▪5、在确定点样位臵时，只需在板上轻轻一点，决不能点得过深，且不能用油笔或钢笔点。
样点位臵一定要高于展层剂层面。
▪6、点样时，要等前一次的样点干燥后，再点下一次，一般每个样点点4次。
▪五、实验注意事项▪7、在进行展层前，要先在层析缸中加入一些层析剂，使整个缸内充满层析剂，以使样品能在一个稳定的环境中进行展层。
▪8、在展层好后，立即用尺量出溶剂前沿距离，不要等到吹干后再量。
▪9、在用吹风机吹干时要注意用小风吹，或者将吹风机离板较远点吹。
▪五、实验注意事项▪10、染色完成后，放臵于烘箱85℃烘时，若烘了10min后有些点还是不显色，可以在记录已显色点的颜色和距离后，继续烘，直至显色为止。
▪11、为了使实验现象明显，提取糖时，宜使糖的浓度高一些。
实验三离子交换柱层析分离氨基酸▪一、目的▪通过实验要求学会装柱、洗脱、收集等离子交换层析技术实验三离子交换柱层析分离氨基酸▪二、原理▪树脂（惰性支持物）结合了阳离子或阴离子后，可与阳离子或阴离子结合。