样品管
—— 0.1 —— 5.0
空白管
—— —— 0.1 5.0
• 各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用 540nm比色，以空白管调零点，读取各管光 密度值。
【注意事项】
• 1．正确使用微量加样器。 • 2．取液要准确。 • 3. 做好标记，不要将试管号弄混。
【思考题】
• 1．分光光度计的使用及计算原理。
【方法步骤】
• 1．取干净试管8支，按下表正确操作：
试剂 1
2345678
0.02M 基质液
0.1
蒸馏水 1.3
碳酸盐
缓冲液 1.5
0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.2 1.1 1.0 0.8 0.6 1.4 1.4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 混匀置37℃水浴保温5分钟
• 3．标本测定：用生理盐水将待测蛋白质样品稀释 成大约1mg/ml溶液。取1.0ml样加生理盐水3.0ml混 匀，按上述方法测其吸光度。
【结果与分析】
• 1．根据标准曲线查出蛋白质浓度。
• 2．也可利用经验公式计算蛋白质含量；适 当稀释蛋白质溶液测其A280nm和A260nm 处吸光度，再用经验公式直接计算蛋白质 浓度。
钼蓝 通过测定钼蓝颜色的深浅计算葡萄糖的含量！
【实验操作】
1．动物准备 取正常家兔两只，实验前预先饥饿，称体重
（一般为2～3kg）。 2．取血
以耳缘静脉取血，先去毛，用二甲苯擦拭兔耳， 使其血管充血，再用干棉球擦干，用粗针头刺 破静脉放血，将血液收入抗凝管中（按10：1 的比例将防凝剂放入试管，边收集（量约3ml） 边摇匀，以防凝固。 用干棉球压迫血管止血。
【实验原理 】
1.体内血糖水平主要依靠激素的调节
主要ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ节 激素
降低血糖：胰岛素
升高血糖：胰高血糖素(glucagon)、 糖皮质激素、肾上腺素
胰岛素(insulin)： 体内唯一降低血糖水平的激素
肾上腺素：主要在应激状态下发挥调节作用。
本实验采用吴宪氏法测定血糖， 要求将血液制成无蛋白血滤液：???
实验一
双缩脲法测定蛋白质含量
【目的要求】 • 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理。
• 【实验器材】
• 中试管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻 度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计
【方法步骤】
• 取中试管3支，按下表操作。
试剂（ml） 标准管
蛋白质标准 待测液 蒸馏水 双缩脲试剂
0.1 —— —— 5.0
3.检测分离效果
（1）纳氏试剂：盐存在时，NH4+ 与其反应呈现黄色或橙色。
（2）双缩尿试剂检测：蛋白质与 其呈现红色或紫红色。
【实验操作】
1．盐析 ⑴ 血清2ml放入离心管中，加入PBS2ml混 匀逐滴加入饱和硫酸铵溶液4ml，边加边 摇匀。静置10分钟后，离心3000 rpm 10 分钟，倾上清液（上清中主要含清蛋 白）。
3．注射激素后取血
(1)取饿兔血后，其中一只兔腹部皮下注射胰岛 素，剂量按0.75u/kg体重计算，并记录注射时 间。一小时后再取血。取血后立即腹腔或皮下 注射25%葡萄糖液10ml，以免家兔发生胰岛素性 休克而死亡。 (2)另一只兔腹部皮下注射肾上腺素，剂量按 0.4mg/kg体重计算，并记录注射时间。半小时 后再取血。
生物化学实验技术
生物化学实验技术
• 实 验一、 双缩脲法测定蛋白质含量 • 实 验二 、紫外分光光度法测定蛋白质含量 • 实 验三 、血清γ-球蛋白的分离与纯化 • 实 验四、碱性磷酸酶Km值测定 • 实 验五、胰岛素和肾上腺素对血糖含量的影响 • 实 验六、 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分析 • 实 验七、 SGPT活性测定 • 实 验八、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶 • 实 验九 、RNA的分离与鉴定 • 实 验十 、DEAE 纤维素离子交换层析法分离蛋白质 • 实 验十一、 质粒的提取与鉴定
【实验目的】
1． 掌握蛋白质分离纯化的主要方法 和原理；
2．熟悉盐析和层析的基本操作； 3． 掌握离心机的正确使用方法。
【仪器试剂】
试管、刻度吸管、吸耳球、胶头滴管、 层析柱、反应板；血清、PBS液、葡 聚糖凝胶G-25、纳氏试剂、饱和硫酸 铵溶液。
【实验原理 】 1.盐析 ：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。
【注意事项】
• 1．本实验所用各种玻璃仪器必须洗净烤干后备用。 • 2．各种试剂的加入量要准确。 • 3．严格掌握加入酶液后的保温时间，否则会影响其
产物量的准确度
【思考题】
• 1．为何可以酶活性单位代表酶促反应速度？ • 2．酶促反应的影响因素有哪些？ • 3．何为Km值？如何测定一个酶的Km值？
2.无蛋白血滤液的制备原理
COOH
2R
+ H2WO4
NH2
COOH
R
WO4
NH2 2
此方法是生物碱沉淀蛋白质
沉淀蛋白质 的方法还有
哪些？
3.利用吴宪氏法测定血糖的原理
G + Cu2+ OH-
△
Cu2O
+糖氧化物
3Cu2O +3H3PO4.2MO3.12H2O
6CuO +
3H3PO4.2MO2O3.12H2O
2.本实验分离全血清中各种蛋白质成分，同 时鉴定上次实验提纯结果。
点样 γ β α2 α1 清蛋白
♁
♁
Γ球蛋白
【实验操作】
1. 准备与点样：用巴比妥缓冲液将醋酸纤维素 薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米处点样， 即上述实验得到的γ-蛋白，另取薄膜一点全 血清。
2. 电泳：点样面朝下，点样端靠近负极，电压 110V，通电40-45min；
实 验二
紫外分光光度法测定蛋白质含量
【目的要求】 • ①了解分光光度法的基本原理； • ②能较熟练使用紫外分光光度计。
• 【实验器材】 • 1．紫外分光光度计。 • 2．微量加样器。 • 3．蛋白标准液（1mg/ml）。
【方法步骤】
• 1．标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏 定氮法测定蛋白质的含量后，用生理盐水稀释成浓 度为1mg/ml的蛋白质溶液。
【仪器试剂】
电泳仪、点样器、镊子、醋酸纤维素 薄膜；巴比妥缓冲液、染色液、漂洗 掖。
【实验原理 】
1.蛋白质是两性电解质，在同一个PH 环境下，混合蛋白质中各种成分带电量 不同、分子大小不同，在同一电场中泳 动的速度不同，导致相同的时间迁移的 距离不同而把它们分开。
（1）分子越小，泳动速度越快
（2）带电量越多，泳动速度越快 反之，越慢。
• 2．计算各管[S]。 [S]＝加入[S]量/3.0×0.02
• 3．进一步计算出各管1/V和1/[S]。 • 4．将上述数据填入下表
数值 1号 2号 3号 4号 5号 6号
光密 度值 V 1/V [S] 1/[S]
以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标，画出各管的坐标点，并将其 连成直线，此直线与横轴的相交点为-1/Km，由此可计算出该 酶的Km。
⑵ 将离心管中的沉淀用1 ml PBS搅拌溶解，再 逐滴加入饱和硫酸铵溶液0.5ml，边加边摇匀。 静置10分钟后，离心3 000 rpm 10分钟 （注意离心机使用时需要配平并且离心时将盖 子盖好）。倾上清液（上清中主要含α、β球 蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白。
2.脱盐：
⑴ 装柱：将制好的葡
酚标准
0.1
液
酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
0.1
充分混匀置37℃水浴准确保温15分钟
0.5％铁 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
氰化钾
• 充分混匀后置室温10min，510nm波长下进行 比色，以第8管做空白，测定各管的光密度。
【结果与分析】
• 1．计算各管酶活性单位。 D测/D标×0.01
沉淀蛋白质 的方法还有
哪些？
（2）盐析的影响因素
蛋白质的浓度 、盐浓度、 pH 值、温度等。
本实验球蛋白在半饱和硫酸铵溶液 中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在 33%浓度的硫酸铵溶液中沉淀。
2.层析：
待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相） 时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及 亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配， 并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。
• 如Lowry-Kalckar公式：蛋白质浓度 （mg/ml）＝1.45A280－0.74A260。
【注意事项】
• 1．加量要准确。 • 2．比色皿的正确应用。 • 3．结果重复3次，取平均值。
【思考题】
• 1．为何要同时测定蛋白280nm和 260nm处的光吸收值？
实验三
（一） 血清γ-球蛋白的分离 与纯化
3．染色：2-5 min； 4. 脱色：直至背景漂净为止。
【实验结果】
根据电泳区带出现的位置和条数判 断是何种血清蛋白，如果只是一条 γ-蛋白说明上个实验分离纯化的较 好。
【实验注意事项】
1．不要用手触摸纤维素膜； 2．注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛
面； 3．点样位置要在1.5厘米以内，不要距边缘
（3）收集：
加样同时可进行收集，每管收集1ml。 收集12 管后加紧螺旋夹。回收凝胶 和尼龙布等。
⑷ 检测：准备反应板两块。将12管收集液 各取1 滴分别放入反应板的12个凹孔。一 块板的各孔内加纳氏试剂1滴，有NH4+ 者呈黄色至橙色。可用＋、－号表示有无 呈色或颜色深浅。再向另一块板的各孔内 加双缩脲试剂1滴，有蛋白者呈蓝紫色。
【实验结果】
可用＋、－号表示有无呈色或颜色深 浅。将双色脲反应呈色最深的一管收 集液保留供下次实验使用。利用醋酸 纤维素薄膜电泳检测本次实验所提γ球蛋白的纯度。