思考题：
1．比较几种方法的优点和缺点？ 2．为什么标准蛋白质必须用凯氏定氮法测定度？ 3．若样品中含有核酸杂质，紫外法测定时应如何
排除干扰？ 4. 说明你所选择的蛋白质样品、制备方法和蛋白
质含量测定方法的依据。
示意图（交换树脂表面）
示意图（离子交换过程）
电离基团（磺酸根） 可交换离子（钠离 子） 交换离子 阳离子交换树脂：可供交换的是阳离子；
阴离子交换树脂：可供交换的是阴离子；
不交换离子
示意图
B物质
水分子
A物质
三、操作步骤
1、装柱
¾ 装柱是最关键的一步。 ¾ 重力沉降法装柱 ¾ 陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面
1.安装膜具
装封胶条，注意封胶条平面朝 下，不能有裂口
盖上凹玻璃
将凹玻璃冲外装进槽里
将楔子插进，将底部插紧
2. 配制凝胶溶液
胶的配制(平行电泳两块胶板)
胶母液： 8.4ml 配胶缓冲液：13ml 蒸馏水：4ml 10% TEMD： 0.2ml，混匀 10%AP： 0.2ml ，混匀
根据以上选择制定实验方案，并确定 具体的实验参数，具体实验步骤和参数的 选择可参考实验教材。
第二部分：样品中蛋白质含量的测定
设计要求： （1）根据所制备的样品中蛋白质的性质选择合适的
测定方法，如粗制品的粗蛋白质含量和蛋白质含 量一般可选择凯氏定氮法，纯化后没有干扰的蛋 白质样品可选择紫外分光光度法等其它方法，标 准蛋白质为牛血清白蛋白。 （2）参考附录中提供的可选用的方法，制定测定的 具体实验方案。
蓝色物质
注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干 扰作用。
按教材表1加入各种试剂，反应后观察并记录结果。
表1 二苯胺反应加入试剂
管号
1
2
3
4
5
蒸馏水/mL
1
-
-
-
-
DNA溶液/mL
-
1
-
-
-
RNA溶液/mL
-
-
1
-
-
提取物一/mL
-
-
-
1
-
提取物二/mL
-
-
-
-
1
二苯ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ试剂/mL
2
2
2
2
2
放沸水浴中10min 后的现象
实验目的： 通过学习的生物化学知识和实验技术，学会
自行设计一种含蛋白质的样品处理方法、蛋白质 制备方法和测定方法。
基本要求：
掌握常用的蛋白质制备和定量测定的方 法及其原理，能够根据样品的种类不同设计 蛋白质制备的方法，并根据蛋白质性质不同 设计选用相应的定量测定方法。
培养目标：
通过实验方案设计及方法选择，使学生 了解不同来源蛋白质制备的基本原理与方 法；熟悉几种蛋白质含量测定方法的基本原 理及应用条件；学会设计并实施一种蛋白质 的制备及测定实验方案；通过实验独立完成 试剂的配制、蛋白质的制备、标准曲线的制 作、蛋白质含量测定、结果计算、方案实施 总结全过程。并能够熟练使用离心机、分光 光度计等进行蛋白质制备和紫外、可见分光 光度测定。
可选择的蛋白质含量测定方法有：
（一）紫外分光光度法 （二）Bradford法 （三）微量凯氏定氮法 （四）双缩脲法等 （五）Folin-酚法
实验报告：
要求给出实验目的、设计方案及设计原 理、实验技术路线和参数选择的依据、实验 参考文献、实验方法和步骤、实验结果和分 析、总结。
第一部分：蛋白质样品的选择、处理及制备
设计要求：
（1）蛋白质样品的选择: 乳制品、植物蛋白、动物蛋白等 （2）处理方法的选择：根据所要制备和测定的蛋白质样品
的来源、种类和特性选择处理的方法——可选择粉碎、匀 浆、超声破壁等方法 （3）制备方法的选择：根据要测定的蛋白质组分选择制备 的方法——要求必需选择一种蛋白质样品的制备方法，如 采用特定溶剂提取后测定特定溶解性的蛋白质、分离纯化 后测定特定组分的蛋白质或除去脂肪等杂质制备粗蛋白测 定蛋白质等等。
(1) 计算迁移率（Rm值）：计算公式见教材。 (2) 绘制标准曲线：以标准蛋白亚基的Rm值为横坐标，以相
应分子量的对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋白质分 子量的标准的线图。 (3) 计算未知蛋白亚基样品的分子量：根据未知样品样的Rm 值，从上述标准曲线图中即可查出其分子量。
实验三 菜花中核酸的分离与鉴定
5. 加 样
6. 电泳
接通电源，电流 恒定为80mA，待溴酚 兰指示剂移至离下端 0.5cm（约3小时）， 切断电源，拔去插 头，倒出电极缓冲液 于大烧杯中（如此缓 冲液欲重用时，应把 正负电极液分别贮 存）。
7. 剥胶
8.染色： 考马斯亮蓝染色，详见教材
9.脱色
10. 凝胶（脱色之后）结果分析
3 实验记录与实验报告
3.2 实验报告 实验报告的格式应为：
⑴ 实验目的； ⑵ 实验原理； ⑶ 仪器、材料和试剂； ⑷ 实验步骤； ⑸ 结果讨论（含数理据处）； ⑹ 注意事项; (7)思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有 关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化 学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析 和见解，并欢迎对实验提出改进意见。
¾ 阳离子交换树脂：可供交换的是阳离子； ¾ 阴离子交换树脂：可供交换的是阴离子；
z 常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联 剂：二乙烯苯）
z 阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基 z 阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 z 可交换离子：阳离子：Na+、H+
阴离子：Cl-、OH-
根据现象分析提取物一和提取物二中主要 含有什么物质?为什么？
思考题：
1．核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物 质？本实验是怎样除掉的？
2．运用本实验方法是否可以制备得到高纯度核酸? 3．快速鉴别RNA和DNA的方法是什么?
实验四 设计性实验——蛋白质的制 备及其含量测定
实验类型： 给定选题的综合设计性实验
（2）苔黑酚反应
测定核糖的常用方法是苔黑酚法（3，5—二羟基甲
苯，即Orcinol反应）。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3， 5—二羟基甲苯在沸水水浴中加热10～20min后，有绿色物 产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛， 后者再与3，5—二羟基甲苯作用生成绿色物质。
CH3
100 o C
生物化学实验技术
Biochemical Experiment
绪论
1 实验目的
z 掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分 离、纯化和测定技术的原理及方法；
z 掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实 验技能；
z 培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学 作风、创新能力等综合素质。
2 通过生物化学实验应该做到
一、实验目的
¾ 学习和掌握从植物组织中分离核酸的原理和方法 ¾ 掌握定糖法测定核酸的原理及操作方法
二、原理
核酸的提取：三氯乙酸或高氯酸除酸溶小分子 有机溶剂去脂类 浓盐溶液（10％NaCl）提DNA 0.5M高氯酸提RNA
RNA核糖的测定:苔黑酚法
DNA脱氧核糖的测定：二苯胺法
三、操作步骤
1、核酸的分离
3、加样
z 上样量：0.3-0.5mL
注意：
¾加样的同时开始收集 ¾加样时且勿搅动树脂床面
z 0.5mL缓冲液冲洗加样处2次
4、洗脱与收集
z 尽量维持衡定柱压
z 每2分钟收集一管，共收集25管
5、氨基酸的鉴定
每个收集管
＋
沸水浴15min
1mL水合茚三酮
比色测定
绘制洗脱曲线
实验二 SDS-PAGE分离蛋白质
4 实验成绩评分方法
实验预习情况（10%） 实验操作情况（20%） 实验报告情况（30%） 实验考试成绩（40%）
实验一 离子交换层析法分离氨基酸
一、实验目的 学习用阳离子交换树脂分离氨基酸 的操作方法和基本原理
二、原理 氨基酸的pI不同，在同一pH下所带电荷的
数量和性质不同，与树脂的亲和力就有差异， 因此可根据亲和力从小到大的顺序依次被洗脱 下来。
一、实验目的 掌握SDS-PAGE的工作原理和操作方法
二、原理 不同蛋白质具有不同的分子量，并在一定
的pH溶液中带有不同的电荷。但经过SDS处理 后的蛋白质，分子表面完全被负电荷所覆盖， 因此在电泳时，电泳迁移率近取决于蛋白质的 分子量大小而与其所带电荷的性质无关。 ¾ 分子筛效应 ¾ 浓缩效应
三、操作步骤
2、平衡
z 层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强 度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体 积相当于4-6倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳 定。装好的柱必须均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交 换剂沉积表面十分平坦。
z 本实验平衡体积：60－80mL
z 调节流速：0.5mL/min或8-12滴/min
RNA+浓盐酸+
OH
OH FeCl 3
绿色化合物
注意：DNA、蛋白质和黏多糖等物质对测定有干扰作用。
按教材表2加入各种试剂，反应后观察并记录结 果。
表2 苔黑酚反应加入试剂
管号
1
2
3
4
5
蒸馏水/mL
1
-
-
-
-
DNA溶液/mL
-
1
-
-
-
RNA溶液/mL
-
-
1
-
-
提取物一/mL
-
-
-
1
-
提取物二/mL
-
-
-
-
1
三氯化铁浓盐酸溶液/mL
2