文读懂  免疫组化步骤、结果分析及注意事项
导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：想拿高分
文章，不学免疫组化怎么行？” 免疫组化王子毛博旁边插话：
是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。

”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry ），是
项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。

免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。

石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。

免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。

但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。

这实在是一件憾事。

如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。

结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。

前者是在40*光镜下，随机10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0 分阴性着色，1 分淡黄色，2 分浅褐色，3 分深褐色）
和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。

免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。

1.对照染色
和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。

没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。

对照
般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身
对照。

般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照
就足够了。

2.定位
抗原表达必须在特定部位。

如LCA 应定位在细胞膜上；CK
应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位在细胞核内等等。

不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。

有可能是非特异性染色或者假阳性。

不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。

3.半定位
现在一般用图像分析系统进行定量。

如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。

因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。

免疫组化的
半定量一般就分为三级：弱（+ ），中++ ），强（+++ ）。

以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和
x 2 +（+++）% x 3 计算出数值；总数值 图像分析仪 如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析
仪。

图像分析 仪类型很多。

这里就不一一介绍了。

其实毛博最想隆重推荐 的是一款图像分析软件：Image J 。

毛博当年在米国做博士猴
的时候，就是用的这款软件。

这是 NIH 开发的免费软件 般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。

现在已经开发到 了 1.50 版。

网上可以免费下载。

其界面非常简洁，如下图所 示。

现在，根据一个实例来看看如何用 Image J 来进行图像 分析。

如下图所示， 我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。

那么，如何用Image J 来计数细胞的个数呢？首先，要把彩
色的图像转换成黑白图像。

步骤如下：Image 宀Type 宀16-bit 。

转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。

步骤 如下：Image 宀Adjust 宀Threshold 。

然后拖动鼠标，直到所有 的细胞被标示出来。

有时候 2 个细胞靠得比较紧密，会被计 数为1个细胞。

这个时候可以采用 Image J 的水洗功能。

步
骤如下：Image 宀Binary 宀Watershed 。

如下图的蓝色箭头所示， 这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地 被计数成了 2 个细胞。

然后，就可以正式开始分析了。

步骤 如下：Analyze 宀Analyze Particles 。

在得出最后的结果之前，
亮绿色耀眼荧光。

弱（ +）=1 ， 中（ ++ ）
=2，强（ +++） =3。

至少随机观察5-10个HPF 。

然后根据（
+)% x 1 +(++)% 1.5 者为 (+++) 。

4.
还有一些选项需要选择。

如果想要计数全部的细胞，那么Size
项里面选择“0-infinity ”。

Circularity 的默认值为“ 0.00-
1.00”。

般就取默认值。

最后的结果如下图所示。

软件自动测量了每个细胞的大小。

这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。

然后计数了一共有72 个细胞，总面积为21286.00，
平均大小为295.64。

免疫组化是个苦活，时间长，步骤多，
还要经常接触有毒致癌物质。

大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子，最后都希望
得出自己想要的结果。

以上，毛博介绍了些自己的心得体会。

希望广大的实
验狗们都能做出自己想要的结果，早点发文章。

非特异性染色的八大原因然而，结
果却未必都是那么如意的，常常出现下面这种状况，好好的体问题，真的是
一分钱一分货啊！
张片子染得脏脏的，这就是最常见的非特异性染色。

1. 抗抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯度，高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。

单克隆抗体很贵，不过结果真的很好。

尤其是背景非特异性染色不会太深。

真是一分价钱一分货。

一抗过期也会造成杯具，所以要注意抗体的有效期。

2. 抗体浓度过高/孵育时间过长一抗浓度太高也是出现非特
异性染色的常见原因。

解决的办法就是预实验。

每次使用新抗体前应该多做
预实验，摸索出最理想的工作浓度，不能简单地按照说明书来用。

另一个常
见原因就是孵育时间过长。

解决的办法就是定时器。

加上抗体后，立刻调好定时器，提醒自己及时终止反应，就会避免这个问题。

3. DAB 染色时间太长/变质DAB 的孵育时间过长，会造成背景非特异性染色。

DAB 的显色时间不是一成不变的，主要靠自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就要马上冲洗。

出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体浓度过低。

DAB 要保存于避光干燥
的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。

图1就冲洗的有
些晚了；图2 就是刚刚好，染色效果棒棒哒!4. 内源性酶和生物素内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别是些内源性酶生物素含量丰富的组织，如肝脏，肾脏，脾脏等。

处理的办法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑(24 mg/mL )加入底物液中，并保持PH 值在7.6-8.2，即
能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，可以用
50 mmol/L 的酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，可以用
0.9%的双氧水来灭活。

对于内源性生物素，染色前将切片浸
于25卩g/mL亲和素溶液中15 分钟，PBS 清洗15 分钟后即
可染色。

也可以24 mg/mL 的卵白素封片15分钟。

5. 组织变干
子染太多片子的时候，容易出现这种情况。

解决的办法就是不要贪多嚼不烂。

一次少染几张。

还有就是试剂充分覆盖组织，超出组织边缘2 mm。

然后用PAP笔在组织周围画
个圈圈，把修复液圈在里面。

避免修复液流走。

圈圈应该距离组织边缘3-4 mm。

6.浸泡时间过长
切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，也会引起杯具。

这都是偷懒的做法。

但是有时候也是可以偷一下懒的。

毛博的独门秘技就是4°C 冰箱。

只要把容器放在4°C 冰箱里，过夜完全没有问题。

7. 清洗不充分清洗一定要充分。

PBS 液一定要双蒸水新配，用之前再次测
PH 值。

缓冲液用0.05 mol/L 的Tris-HCL , 0.15 mol/L 的NaCI 即可。

如果加一点去垢剂Tween-20 就更好了。

8. 封闭血清问题
是否选择了正确的封闭血清。

原则是选择二抗动物的非免疫稀释为3- 1 0%的溶液孵育切片，37°C 10-30分钟。

这里不用
血清，例如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。

用PBS 洗，直接甩掉即可。

毛博再贡献一个独门绝招，直接用奶粉也可以。

用5%的脱脂奶粉就可以了。

而且效果还不错。

怎
么样？简单吧。

师傅领进门，造化看个人了。