• 碱性 pH 修复液常对绝大多数抗体的效果更好
• 推荐使用：EDTA缓冲液 pH 8.0或Tris-EDTA缓冲液pH 9.0 是较好的常规修复液，可用于大多数热修复有效的抗体
抗体孵育条件
• 主要抗体浓度、温度、时间，三者一般是相互成 反比的（相对）
• 浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度， 时间决定反应的量
化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 • 4）滴加一抗，室温或 37℃孵育30-60分钟，或 4℃过夜，PBS或
TBS浸洗3分钟×5次。 • 5）滴加enhangcer 增强剂（试剂A），37度30min ，PBS或TBS浸
洗3 分钟×5次。 • 6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温37℃孵
• 80℃烘烤1～2h
• 玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性
冰冻切片的处理
• 冰冻切片的组织抗原保存好 • 通常以5um的厚度为佳 • 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱
短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存 • 缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细
胞肿胀等现象
细胞涂片的处理
组织发硬发脆 • 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷， 而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片
标本的切片、捞片、烤片
• 切片通常以3～4um的厚度为宜,太厚易掉片，细 胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想
• 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（48～ 50℃）
• 培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固 定2遍，4 ℃或－20 ℃冰箱保存
抗原修复
• 概念:应用物理或化学的方法将组织固定过程中
封闭的抗原决定簇修复暴露的过程称为抗原修复
• 原因：甲醛固定过程中形成醛键和羧甲基而封闭
部分抗原决定簇，固定时，蛋白与蛋白之间发生 交联,可能会封闭抗原决定簇
抗原修复的方法
• Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织 或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化 技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位， 但敏感性远远低于免疫组化技术
• ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定 量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一
育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。 • 7）应用DAB 溶液显色。 • 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
Envision系统的优点
敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单
石蜡切片标本的固定
1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗
• （2）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的 棕褐色，说明抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要 下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间；或前面的封闭非特 异性蛋白不全，需要延长封闭时间
• （3）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染 色，说明抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度 过夜）；或封闭时间过长
• 按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物 酶- 抗过氧化物酶（PAP ）法；亲和连接，如卵 白素- 生物素-过氧化物酶复合物（ABC ）法、链 霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等
• SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型 二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高 的组织抗原检测
原决定簇的暴露，产生阴性结果 4、固定液的量要超过组织体积5倍以上
如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞 核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不 理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失
固定不充分
标本的取材、脱水、浸蜡
• 标本的取材厚度以2mm为宜 • 梯度酒精脱水尽量彻底充分 • 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
可被检测的物质
• 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白 质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进 行检测
免疫组织化学的特点
• 1）特异性强 • 2）敏感性高 • 3）定位准确、形态与功能相结合
Western blotting、ELISA 与免疫组化的异同
免疫组化对照和质量控制
• 阳性对照 • 阴性对照 • 免疫组化的标准化 • 外部质量控制体系
脱水、透明、封片、拍照
• 脱水、透明要彻底 • 封片时尽量避免留有气泡 • 拍照尽量在两周内 • 拍照尽量选择干净、清晰的视野，无杂质无破碎
组织 • 所拍照片尽量在同一种状态下，使背景保持一致 • 照片标识清楚
9. 自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。
10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明， 中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接 用水性封片剂封片。
二步法(Envision系统)
• 1）脱蜡、水化组织切片。 • 2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 • 3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧
素等的二抗进行反应 • 通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，
在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成 分的分布和含量
免疫组织化学的分类
• 按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、 荧光标记和放射性标记等
• 按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接 法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间 接法的灵敏度提高了许多
• 解决方法：采用较短时间热修复或酶消化重复实验
修复过度的实验组
修复过度的实验组
修复过度的对照组
修复过度的对照组
酶消化修复
缩短修复时间
热抗原修复的问题：内源性生物素
热修复抗原会导致内源性生物素反应增强，应用 卵白素抗生物素系统会产生假阳性
富含内源性生物素的组织： — 肝细胞 — 线抗体丰富的组织如肾脏、甲状腺、嗜酸细胞等 — 胞浆丰富的肿瘤细胞
• 温度有 4 度、室温、37度，其中4 度最佳，反应 最温和，背景较浅；而 37度反应速度较快，时间 较短；室温不太提倡
• 4度过夜和从冰箱拿出后需37度复温45min
复温的必要性
• 防止切片从4度直接放入PBS易脱片
• 使抗原抗体结合更稳定 4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机 率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性 也提高了并易造成非特异染色
片架放进沸腾的修复液时需轻柔
背景染色较深的原因
• （1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原 因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对 其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到 适合自己实验室的理想工作浓度
• （2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法 是，严格执行操作规程，避免因遗忘而造成时间 延长。时间和温度要根据染色结果进行调整
• （3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用 现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的 DAB不应存放时间太长，DAB的显色最好在显微 镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应
• （4）组织变干
• （5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长 （大于24小时）
• （6）一抗变质、质量差的多克隆抗体
高压锅热抗原修复
• 比微波更有效
–能处理大批量的切片 –达到更高的温度 –加热均匀（不像微波炉有热点和冷点）和节省时间
高压锅热抗原修复
• 将高压锅中的缓冲液煮开（不加盖） • 将切片放入沸腾的缓冲液 • 盖紧盖子和高压阀，加热至全压力 • 达到全压力后才能计时，最佳时间由各个实验室自
行确定----通常在2-4分钟
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂 C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
7. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶 溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
8. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液， 显微镜下观察3-10分钟。
阻断内源性生物素的方法
组织在热修复之后，用3％的新鲜H2O2进行封闭， 以 阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min， 再用10％鸡（鸭）蛋清阻断10～15分钟，清洗后滴加 一抗
应用非生物素系统的检测试剂盒，如EnVision系统
热抗原修复的缓冲液
• pH6.0 柠檬酸缓冲液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品 化修复液等
• 酶消化： 如胰蛋白酶、蛋白水解酶 • 热抗原修复（HIER）：
水浴；微波炉；高压锅；高压消毒锅；蒸汽室 • 超声波 • 以上综合运用
• 修复方法从强到弱为：高压修复、微波修复、胰酶修 复
热抗原修复
• 更有效：染色结果更一致，操作更单一 • 事先确定的热修复时间可适用于几乎所有的组织 • 一抗可以进一步稀释（节省费用） • 有些抗体只有采用热抗原修复才有效
免疫组织化学方法的基本步骤
• 组织和细胞的处理 • 抗原修复 • 染色
鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）
鼠单克隆抗体 • 特异性较高 • 背景较干净 • 有多种潜在用途 • 但敏感性、亲和力低
兔多克隆抗体（兔抗血清） • 高敏感性、亲和力 • 可能有较多的交叉反应 • 更多的潜在用途