（4）利用重组DNA技术可以在体
外大量扩增、纯化人们感兴趣的基
因，研究其结构、功能及调控机制，
从而拓宽了分子生物学的研究领域。
（5）医学上应用更为广泛，涉及各领域
正常人类生命活动的分子机制； 人类各种疾病发生的分子机理； 人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、 肥胖、心血管疾病、传染病等病因 的 查明、诊断、治疗和预防。 药物的研发和生产； 疾病模型的建立； 人类的营养、健康、长寿和保健（亚健 康）
基因重组：不同的DNA分子间发生共
价连接形成重组DNA 分子。
SV40DNA
DNA片段
（用DNA末端转移酶，而非限 制性内切酶）
T4DNA连接酶
重组DNA
2、1973 年Cohen 成功地进行 另一个体外DNA重组实验 分别把编码卡那霉素和四环素抗性基 因的两种质粒酶切、连接，再将这种重组 的DNA分子转化大肠杆菌，某些转化菌落 具有既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗体 特性。 他的工作是世界上第一次成功的基因 克隆实验，并有基因表达及新的表型。
4、大肠杆菌DNA转化体系建立
1970年发现氯化钙处理过的细胞易 于吸收接纳外源DNA； 1972年Cohen C报道，质粒DNA也能 被大肠杆菌吸收。 而后发现经过改造的质粒、噬菌体 和病毒都可以携带目的DNA片段和基因， 经过转化大肠杆菌，建立该基因的无 性繁殖系。
5． DNA分析、鉴定技术
3．生物遗传的“中心法则”解决了
遗传信息的流向和遗传性状的相互关 系，揭示了生命遗传信息传递基本规 律。
DNA RNA
protein
自我复制，遗传信息由父代传给子代； 通过转录，遗传信息传给RNA； 通过翻译，信息传给蛋白质和酶； 基因型决定生物的表型。
4．“操纵子”学说揭示了基因表 达和调控的概念。 基因组结构 基因分布 基因表达 基因调控的 酶诱导的本质
解决了信息语言的对应关系。
6、生物进化，基因突变、 获得的性状可以一传到 后代。
分子遗传学理论上的六大进展解决了


生命现象的遗传物质基础（均是核酸） 结构模型（同类构件、双螺旋） 复制方式（相似的机制） 遗传信息流动方向（共同的中心法则） 遗传密码（共用一套相同的密码） 表达和调控的机理（类同的方法） 基因突变机理、意义（变异与进化） 为基因工程技术的诞生典定了理论基础。
2．DNA片段载体系统的构建
目的基因、 DNA片段不能复制，也易破 坏。必须连到具有复制能力的DNA分子上。 载体（vector) 是能携带外源DNA、能自 我复制的小DNA分子。 最早发现的是：质粒、噬菌体和病毒。
3、大肠杆菌受体细胞系统建立
体外获得的含目的基因或DNA片段 的重组体，虽具有自我复制的本能，但 没有原料、酶系统和生命活力。必须将 其安全转移到宿主细胞才能进行增殖， 赋予其“生命”。
（3）重组DNA技术使人能对生物 进行定向改造。
重组DNA技术革命标志着人类控制和改造生 物的历史已进入一个新纪元。以重组DNA技术 培育出抗真菌蔬菜为例，几丁质是真菌细胞的 组分之一，几丁质酶能水解几丁质，美国科学 家将几丁质酶基因导入西红柿、土豆、莴苣和 甜菜中，正准备大田试验，这一技术将对蔬菜 抗真菌感染具有重要意义。
理论上的可行性。
二、分子遗传学新方法是基因工程的 技术基础（六大技术）


首当其冲的是要解决： ① 如何自如地得到目的基因； ② 如何在体外改造基因，得到重 组体； ③ 在体外转移重组基因； 直到20世纪70年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。
1．工具酶的发现：
DNA分子的切割和连接技术。
材料、实验条件、时空条件、 经济条件和政策。
基础方面的基本条件（可能性+可行性+ 可操作性）具备，尚需人的科学创新思维+ 艰苦的实践。才能得到创新的发明、发现 和成果。
1970年， MIT 的科学家率先提出在 体外能把不同来源的遗传物质进行重组的 设想，但遭到反对，不予支持。没能进行 试验。 1972年， Boyer在发现限制性核酸 内切酶EcoR I 的基础上，开始了实验。
5．破译了全部生物遗传密码， 确定了它在生物界的通用 性，人类更加具体地了解 遗传信息表达规律。
* 人工合成mRNA时破译出第一个遗传密码
子；




三联密码的语义性： 三个核苷酸组成一个密码（codon）决定一 个氨基酸。64个密码子，起始密码子、终止 密码子 三联密码的通用性 ； 三联密码的兼并性； 三联密码的偏嗜性（偏爱性） 三联密码的遗传和变异（突变）性，能导致 多肽链上氨基酸改变，功能改变。
Welcome to Genetic Engineering
第二章 基因工程
（Gene engineering）
概 论
学习内容

概论 运输工具：质粒和噬菌体 DNA纯化技术 DNA操作技术 细菌转化技术 表达载体 克隆基因的表达
要
求
1、掌握基因工程的概念
2、掌握基因工程的基本过程 3、熟悉工具酶和载体类型及应用 4、熟悉原核、真核细胞转染、表 达的基本方法和类型。 5、了解基因工程产生的基础和过程



基因工程的概念 基因工程的发展史 理论上的六大发现 技术上的六大进展 发展过程中的重大事件 基因工程的意义 基本步骤
一、基因工程的概念
人们按照预定设计，在体外对不同来源 DNA分子进行人工切割、连接、插入载体DNA
分子，使遗传物质重新组合、改造，经转移、
导入到原先没不含有重组体的受体细胞，使 之持续稳定繁殖、目的基因扩增、表达，获 得人类所需的产品的工程。
生物技术的核心内容 基因工程（Gene engineering） 黄金工程 (Gold engineering)

DNA重组（recombinant DNA technology） 基因操作（gene manipulation） 基因克隆（gene cloning） 分子克隆（molecular cloning） DNA克隆（DNA cloning） 基因修饰（gene modification）

Cohen等获得了抗四环素和新霉素的重组 菌落TcrNer，标志着基因工程的诞生。
Kanamycin
R6-5 Tetracycline pSC101 Kanr and Tetr EcoR I DNA Ligase
pSC101
pR6-5
抗四环素
EcoRI
DNA连接酶
抗卡那霉素 抗卡那霉 素基因
重组DNA分子
基因工程的目的
（1）获得目的基因，DNA因子、多肽药物疫苗 等，诊断和防治疾病。 （3）研究基因结构、功能等
有关术语解释：



克隆（ clone) ：无性繁殖系 克隆化（cloning）：构建无性繁殖系的操 作过程。 DNA嵌合体（DNA chimera） ：不同来源 DNA插入载体分子所形成的杂合分子（嵌合 DNA），又称重组体。 重组（ recombination）：构建DNA嵌合体 分子的过程
大肠杆菌
培养平皿
四环素\卡那霉素基因
四环素平板
卡那霉素基因
Boyer-Cohen 实验
后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101质粒重组，转化大肠 杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。 这是第一次成功的基因克隆实验。
1974年，首次实现异源间基因重组。 把小鼠的生长激素基因在大肠杆菌中表达。 大争论、大讨论，有反对意见。 科学家的责任和坚持真理。
(科研思维与方法）。
6. 设计一个基因克隆的程序。
参考书




楚雍烈， 现代生物技术（西安交通大学讲义） Gene cloning, T.A. Brown.3rd edition. 基因工程原理，吴乃虎编著，科学出版社 基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版 社。 分子克隆实验指南，J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis, 金冬雁，黎孟枫等译，科学出版社。
*
* 1976年，世界上第一个基因公司在
美国成立，“Genetech”注册登记，意味着 基因工程的实际应用已跨入商业运作的门槛。 生物工程从此进入产业化，
* 1978年，人类的第一个基因被克隆。人 生长激素抑素基因被重组到大肠杆菌的质粒 DNA 。 * 1978-1979胰岛素基因在大肠杆菌中表达 * 1979年，开始研究病毒的基因克隆与表 达，并获成功。试图先绕开人类的基因操作。 * 1980年，人类又克隆了人的降钙素基因, 实验室表达。 *1985年 Horsch 发明了植物基因工程的 基本方法：叶圆盘法，并获得转基因植株
一、基因工程诞生的理论基础
20世纪中期分子遗传学理论的重大进展, 六大发现： 1．确定了生物遗传的物质基础是DNA 肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化试验 噬菌体DNA转化实验
● 1944年，美 国微生物学家 Avery证明基 因就是DNA分 子，提出 DNA 是遗传信息的 载体。
2．DNA分子双螺 旋结构模型和 半保留复制 DNA碱基配 对规律和X衍 射研究 DNA双螺旋 结构模型。

Smith发现了第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶 (restrictien endonuclease，RE) HinfⅠ对DNA分 子有特异地切割作用。 （手术刀剪） Khorana又发现了T4DNA连接酶（Ligase），


能将DNA片段连接在一起。（缝纫机、浆糊） DNA、RNA聚合酶和反转录酶等合成酶。（复印机） 构成了一个研究DNA、 RNA分子的工具酶箱。
基因工程的大胆尝试
Berg等人使用此酶在体外对猴病毒 SV40的DNA和λ噬菌体的DNA分别酶消化， 再用T4DNA连接酶将两种片段连接起来， 得到SV40和λ DNA的重组杂种DNA分子， 率先完成了世界上第一次成功的DNA体外 不同物种之间的DNA重组实验（片段重 组）。