导入
问题：获取目的基因的方法有哪些？
思考1：如果我们对目的基因的碱基序列 完全未知，怎样办？如何操作？ 思考2：如果我们已知目的基因的碱基序 列，可以怎样操作？ 思考3： 如果我们已知蛋白质的氨基酸序 列，又可以怎样操作？ 思考4：如果我们知道目的基因两端的部 分碱基序列，还可以怎样操作？

聚合酶链式反应（PCR技术）
一.基因工程的基本操作步骤（技术 DNA 片段 材料
提取 反转录
形成重组 DNA分子
导入
形成重组 体 目的基因
mRNA
目的基因 (cDNA)
2.化学合成法 目的基因的核苷 酸序列是已知
导入
化学合成法
问题：获取目的基因的方法有哪些？
思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完 全未知，怎样办？如何操作？ 思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列， 可以怎样操作？ 思考3： 如果我们已知蛋白质的氨基酸序 列，又可以怎样操作？
思考：能否根据氨基酸的序列获得人胰岛 素基因的碱基序列？
化 学 合 成 法
一.基因工程的基本操作步骤（技术 DNA 片段 材料
提取 反转录
形成重组 DNA分子
导入
形成重组 体 目的基因
mRNA
目的基因 (cDNA)
2.化学合成法 目的基因的核苷酸序 化学合成法 列是已知 或可推测的
思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全 未知，比如:如果我们对抗虫基因的碱基序列 完全不知道，怎样从苏云金芽孢杆菌体内获 取目的基因（抗虫基因）？ 如何操作？
例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因
大片段DNA
目的基因
打成许多小片段
小片段DNA
载入运载体
如果运气不 好，在打成 小片段时， 有可能把抗 虫基因打 断……
重组 DNA 分子
农杆菌转化法
侵染 植物体细胞 植物组 农杆菌 (整合到细胞 织培养 转基因 植物 染色体DNA上)
基因枪
利用压缩气体产生的动 力，将包裹在金属颗粒 （有钨粉粒子和金粉粒 子，粒子的直径一般在 0.6～4um）表面的表达 载体DNA打入受体细胞 中，使目的基因与其整 合并表达的方法。 这是单子叶植物中常 用的一种基因转化方法， 但是成本太高。
CaCl2处理 感受态细 重组DNA分子 菌细胞 增大细胞壁通透性 (基因表达载体) (工程菌)
吸收DNA分子
重组 DNA进 入细菌细胞
目的基 因随受 体细胞 的繁殖 而复制
如果是导入动物细胞
思考： 培育转基因动物时，受 体细胞能否采用动物体 细胞？试说明理由。一 般可以采用动物的什组 大有 有全部基因
思考： 如果想知道一种生物在个体发育的不同阶段表？
思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完 全未知，怎样办？如何操作？ 思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列， 可以怎样操作？
导入
获取大量目的基因
第二 个循 环
第 一 个 循 环
第 三 个 循 环
最快第几轮能得到目的基因？
体内DNA复制 模板 解旋 引物 酶 DNA分子
体外PCR扩增 目的基因
解旋酶
RNA引物
高温（加热至95℃）
DNA引物
解旋酶、DNA聚合酶等
TaqDNA聚合酶
• 人工基因合成法
DNA合成仪
PCR扩增仪
Taq DNA聚合酶有耐高温的特点
思考：PCR技术扩增目的基因，需要什么前提和 条件？过程如何？原理是什么？
聚合酶链式反应(PCR技术)扩增 前提： 有一段已知目的基因（两端）
的核苷酸序列,以便根据这一 序列合成引物。
条件： 模板DNA（目的基因） 两种DNA引物
四种脱氧核苷酸 耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) 原理： DNA复制 目的： 获得大量的目的基因
显微注射仪
用口径为1μm的DNA注射器，将大 量的目的基因片段注入到受精卵的 核内，然后把经过注射的受精卵移 植到另一只雌性动物的子宫内，使 受精卵发育为转基因动物。
一.基因工程的基本操作步骤（技术） (一)获得目的基因 (二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体) (三)目的基因导入受体细胞 1. 转基因微生物
按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关
检测转基因生物体内是否已含有目的基因
检测目的基因是否已转录出了mRNA
同理： 核酸分子杂交技术 思考：受体细胞摄入目的基因后就说明目的基 因完成了表达吗？
按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关
restriction endonuclease
DNA linking-enzyme DNA linking-enzyme
利用基因工程原理让大肠杆菌生产人胰岛素 又需要哪些基本操作步骤呢？
第二节
基因工程的原理和技术
胰岛素基因
人体细胞
获取 目的基因
随细菌的增殖，胰岛素 基因也同时复制
导入 受体细胞 大肠杆菌 目的基因 检测与鉴定 获取胰岛 素基因的 表达产物 －胰岛素
•据图回答：一个表达载体的组成，除了目的基 因外，还必须有哪些基本元件？
一.基因工程的基本操作步骤（技术） (一)获得目的基因 (二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)
通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同 的粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子 （基因表达载体）。
花粉管通道法
花粉管
卵细胞
受精后
花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花 粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的 基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
3. 转基因植物
重组 DNA 分子
农杆菌转化法
侵染 植物体细胞 植物组 农杆菌 (整合到细胞 织培养 转基因 植物 染色体DNA上) 基因枪或 花粉管通道法
基因表 达载体 的组成
启动子 目的基因 终止子 复制起点 标记基因
用BamHⅠ对胰岛素基因和质粒切割，加入 DNA连接酶，得到的都是重组质粒吗？
含目的基因的DNA片段
载体
BamHⅠ
BamHⅠ
DNA连接酶 重组体
目的基因 自连
载体自连
思考：如何 避免质粒和目的基因的自身环化？
双酶切连接：
1、避免载体和目的基因的自身环化、载体和目的基因间反向连接 2、提高重组DNA分子的重组率
思考：
能否根据mRNA合 成没有内含子的 胰岛素基因？
逆（反）转录法合成目的基因：
RNA链 DNA链
逆转录酶
核酸酶H
水解RNA
DNA聚合酶
单链 RNA （mRNA)
杂交 双链
单链 D（技术 DNA 片段 材料
检测个体是否具有目的基因所对应表现型
如何检测 ？
思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？
没有质粒
正常质粒 含目的基 因的质粒
含目的基因的质粒
正常质粒
没有质粒
DNA分子杂交法检测目的基因
DNA分子杂交法
DNA分子探针法
制作方法： 化学合成或PCR法合成 特点：1.被放射性同位素标记 2.目的基因片段 3.单链DNA 原理： 碱基互补配对，检测未知DNA分子 用途： 目的基因检测,DNA指纹,亲缘关系测定, 基因诊断。
变性：双链DNA解链 成为单链DNA 复性（退火）：部 分引物与模板的单 链DNA的特定互补部 位相配对和结合 延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链
PCR技术与原理
1.变性 升温至95℃ 解旋 双链 DNA 单链 DNA 2.复性 降温至60℃ 引物与母 链结合 3.延伸 升温至72℃ DNA聚合酶
一.基因工程的基本操作步骤（技术） (一)获得目的基因 (二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体) (三)目的基因导入受体细胞 (四)目的基因的检测与鉴定
•问题1：根据中心法则，目的基因怎样 表达？成功表达的标志是什么？
按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关
检测转基因生物体内是否已含有目的基因 检测目的基因是否已转录出了mRNA 检测目的基因是否已翻译出了蛋白质
大肠杆菌的拟核
如果是导入微生物（如细菌）
感受态：细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。
处于感受态的细胞称为感受态细胞.
感受态细胞
CaCl2
0℃
42℃
重组载体
一.基因工程的基本操作步骤（技术） (一)获得目的基因 (二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体) (三)目的基因导入受体细胞 1. 转基因微生物
一.基因工程的基本操作步骤（技术） (一)获得目的基因 •问题：怎样将目的基因与质粒进行重组？
质粒
重组DNA 限制酶
目的基因
DNA连接酶
质粒 外源基因
同一种限制酶切割
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
问题2：形成的重组质粒导入受体细胞后，除了能 够稳定存在外，并且可以遗传给下一代。同时，使 目的基因在受体细胞中表达和发挥作用，需要对重 组质粒作怎样的修饰？
形成重组 DNA分子
质粒
大肠杆菌
胰 岛 素
基因工程（将人胰岛素基因转入大肠杆菌）
基因工程的基本操作步骤（技术）
剪切 拼接 导入 表达
（一）获得目的基因 （二）形成重组DNA分子
（三）将重组DNA分子导入受体细胞
（四）目的基因的检测和表达
1、筛选含有目的基因的受体细胞 2、目的基因的表达
问题：操作步骤（技术 DNA 片段 材料
形成重组 DNA分子
导入受体菌 构建 基因组 群体思考：从基因组中获取人的胰岛素基因， 导入大肠杆菌能否成功表达？为什么？
重组DNA 白的菌落 该菌落所携带 的基因
目的基因 打成许多小片段
小片段DNA
载入运载体
重组DNA分子