用限制酶剪去 多余部分
限制酶
目的基因
• 目的基因的提取方法
直接分离基因 ：鸟枪法
人工合成基因
反转录法
根据已知的氨基酸序列 合成DNA
1）鸟枪法： (散弹射击法、直接分离法) 供体细胞中的DNA 限制酶 许多DNA片段
与载体连接
目的基因 分离
运载体 导入 受体细胞
载入
外源DNA扩增
产生特定性状
用DNA重组技术将某种生物的总DNA 用特定的限制性内切酶切割成一个个片 段，然后将这些片段随机地连接在某些 质粒或其他载体上，再将它们转移到适 当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构 成各个片段的无性繁殖系（克隆），当 这些克隆多到可以包括某种生物的全部 基因时说明目的基因完 成了表达吗？ 不能，受体细胞必须表现出特定的性状， 才能说明目的基因完成了表达。
若不能表达， 要对抗虫基因 再进行修饰。
多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培 养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄 入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出 相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应 变化的个体进一步培养、研究。 例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。
1）DNA序列自动测序仪： 对提取出来的 基因进行核苷酸 序列分析。
2）PCR技术： 使目的基因的 片段在短时间内 成百万倍地扩增。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) PCR 基因放大连琐反应
染色体
PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大
2）聚合酶链式反应 即PCR技术
抗虫棉的培育流程图：农杆菌转化法
从苏云金芽苞杆菌中提取 抗虫基因 同一种限制 酶处理 从土壤农杆菌中提取带 有选择性标记的质粒 将土壤农杆菌与棉花 细胞混合培养 侵 染 植物组织培养 重组质粒将抗虫基因导 入棉花细胞并整合到棉 花的DNA上 获得抗虫棉 筛选
抗虫基因与质粒结合形成 重组质粒
将重组质粒导入土壤农杆菌
练习
4）有关基因工程的叙述正确的是 （ D ）
A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体
D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料
练习
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计 施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行 碱基互补配对的步骤是 （C） A、人工合成目的基因
（四）目的基因的检测和表达
初选
氨苄青霉 素抗性基因
四环素 抗性基因
再次检测
检测—
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 方法—— DNA分子杂交 ②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法—— 抗原—抗体杂交
鉴定—— 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
启动子
RNA聚合酶 RNA聚合酶
结构基 因
RNA聚合酶
半乳糖苷酶 酶 酶
终止子：位于基因的尾端的一段特殊 的DNA片断，能终止mRNA的 转录
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞 中是否含有目的基因，从而将有目的 基因的细胞筛选出来
基因组
载体
限制性内切酶
目的基因
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
载体自连
（二）基因表达载体的构建
基因表达载体的组成：
a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 e、复制原点
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存 在，并且可以遗传给下一代，同时使目 的基因能够表达和发挥作用。
启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片 断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了 它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
目的基因 自连
（三）目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。 受体细胞 转化 ——目的基因进入_________内，并且在 稳定 表达 受体细胞内维持_____和_____的过程
将目的基因导入 植物细胞 方法
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
练习
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 （ D）
D、它是环状DNA
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A ）
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起 来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物
限制酶消化
开环载体DNA 重组体
DNA连接酶
目的基因
转化 体外包装
带重组体的宿主
筛选
表型筛选 DNA分子杂交鉴定 抗原抗体反应 个体水平
练习
1）以下说法正确的是 （C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来
基因操作的基本步骤
基 因 工 程 的 基 本 过 程
基因操作的基本步骤
1）获得目的基因（目的基因的获取 ）
2）制备重组DNA分子（基因表达载体的构建 ） 3）转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞） 4）筛选重组细胞 目的基因的检测和表达
5）实现功能表达
(一）获得目的基因
供体生物细胞
将需要的基因从供体生物 的细胞内提取出来。 取出DNA 目前被较广泛提取使用的 目的基因有： 苏云金 杆菌抗虫基因、人胰岛素 基因、人干扰素基因、种 子贮藏蛋白基因、植物抗 病基因等。
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
D、目的基因的检测和表达
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞 将目的基因导入 ——感受态细胞 微生物细胞
1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法
（1）农杆菌介绍 （2）原理及适用范围
2、将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法 （2）程序：
将目的基因导入微生物细胞
1.常用菌： 大胞→ 感受态 细胞 →表达载体与感受态细胞混合→ _________细 感受态 胞吸收DNA分子。 3.转化方法： Ca2+
• 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？
优点 鸟枪法 缺点
操作简便 广泛使用 专一性强
工作量大，盲目，分 离出来的有时并非一 个基因 操作过程麻烦，mRNA 很不稳定，要求的技 术条件较高
反转录法
根据已知氨基酸 专一性最强 仅限于合成核苷酸对 合成DNA法 较少的简单基因
• 哪些新技术能大大简化成的信使RNA为模板， 反转录成互补的单链 DNA，然后在酶的作用 下合成双链DNA，从而 获得所需的基因。 目的基因的mRNA
反转录
单链DNA(cDNA)
合成
双链DNA (即目的基因)
3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白 质的氨基酸序列，推测 蛋白质的氨基酸序列 推测 出相应的信使RNA序列， 然后按照碱基互补配对 mRNA的核苷酸序列 推测 原则，推测出它的结构 基因的核苷酸序列，再 结构基因的核苷酸序列 通过化学方法，以单核 化学合成 苷酸为原料合成目的基 目的基因 因。