核酸测序 确定重复模式
确认重复序列和重复单元数 14个确定指标
区分效能评价
9个指标的MLVA策略
21
串联重复的鉴定
TRF 软件
（Tandem Repeats Finder software）
://minisatellites.u-psud.fr/
• • • • 匹配赋2分 不匹配-3分 碱基缺失-5分 最小报告分值50分
98HAH12 SC84
22
串联重复的鉴定
23
串联重复的鉴定
Indices 1858865--1858900 1862974--1863158 1867321--1867363 Period Size 12 46 16 Copy Number 3.0 3.9 2.6 Consensus Size 12 46 16 Percent Matches 70 78 70 Percent Indels 0 4 7 Score 52 228 52 A 36 22 25 C 5 23 25 G 33 12 13 T 25 40 34 Entropy (0-2) 1.79 1.89 1.93
PCR primers:
CTCCCACACCCAGGACAC PCR CGGCCTACCCAACATTCC
230 bp
strain H37Rv : 215 bp
300 bp 200 bp
Gel migration
strain CDC1551 : 230 bp
测序分析
230 bp 215 bp 200 bp 7
Tandem repeat sequence
CGTTAAGCAAATCCTAGACAAAATAGGAAATCGAAGCAGATAGCTTCAATCAAGGAGATTT ATCTTTTTGCCAGAATTTGTAGCTCGAATTCAACTAAGATTAAGATAGAGGA AGCAGCCTGTAGTTGAGGCACCTGTAGAGGAAGTTGTAG CAAGAAAAAATGGTCCATTCTCGCCGTTGCGCCTTTCCAGTTTCTTGGGCG ATATTGAAACCTCTGAAAAACAGATGCCAAGTATTGTGAACGACAATGTCGTAACACCTGA AAAGCAAATGGCTAATAAAGAGAACGATA AAGGTCCGGTGGACCTTTTTATCATGAGCATGAAAACAAGAAAGCGAATT CGTTGCTGGTACCGTAGCAGTTGCATCAGT AAAATATAGA CCAGAAGAGCCAAAACAAGACGCTCCACAAGCGCCATCAACACCGGAAAAACAAACAGAA GAACCGAACAAGGAAGAACCTAAGAAAACACCACAAGCGCCATCGACTCCGGAA AAACAACCAGAAGTACCGGAATCACCAAACCCAGAGACACCAGACGCGCCATCGA CTCCAAAAGATGAACCGCAAGCTCCATCAATCCCAGAAGAAAAACCAAAAGTA GAGCA
24
串联重复的鉴定
25
26
inserted a small segment
泳道 菌号
1 SC22
2 NJ25
3 9802
4 9801
5 GZ1
6 89-1591
7 P1/7
8 R735
9 ATCC43765
10 11611
11 HASS-73
12 SC061001
13 SC06238
14 06GZ1
2 1
3 2
3 3
1 0
36 26
ST1 ST81
+ + - - -
1.7 1
10
分析软件：BioNumerics
• 命名MLVA型：MT1-MT85
• 评价各位点的分辨力：
Nei’s index = 1-Σ (allele frequency)2 • 评价MLVA方法的分辨力： Simpson's index = 1 - Σ [nj (nj-1)]/[N (N-1)]
菌株名称 GZ1 P1/7 05ZYH33
血清型 2 2 2 2 2
来源 (CP000837) (www.sanger.ac.u k) (NC_009442) (NC_009443)
ST 型 ST1 ST1 ST7 ST7 ST7
• 以猪链球菌为例： • 鉴定了750,749,790,784 • 测序菌株基因组串联重复位点的比较
100 bp
VNTR和等位基因
下游序列
VNTR 重复 Primer-F
atgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgat
上游序列 Primer-R
重复拷贝数 =
扩增大小-上下游序列 重复单元的大小
取整：就近取整或去除小数取整
8
串联重复序列可变重复数目的判定
9
MLVA方法
4
VNTR
• VNTR：可变数目出那里重复序列， Variable Number of Tandem Repeats •
重复单元
AACTTTACGTTC AAATTAACGTTC AAATTAACGTTC AAATTTACCTTG
侧 翼 序 列
5
18bp*3
• AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGC TGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGG GCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCA GGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGA
217185--217309
12
9.7
12
58
14
87
27
16
34
21
1.95
29
第三部分
MLVA方法在猪链球菌分型中的应用
30
猪链球菌暴发疫情
• 2005年-四川人感染猪 链球菌暴发疫情 • 215人感染、39人死亡 • 波及四川36个县的202 个村庄 • 重庆， 贵州， 广东， 江西也发现病例
• SmaI酶切：ST7型分为单一的PFGE-01型 • 2005，2006年和2007年中国ST7菌株： PFGE-01型
Ye, et al. 2006. Emerg.Infect.Dis.
32
猪链球菌MLVA指标和特征
cod e Location in GZ1 Locus§ Matches In GZ1 % Tm℃
using arithmetic averages)
• 等分权重 • 分类图/最小生成树的形式展现 • 多态性指数： Simpson’s index
16
MLVA方法的应用
• • • • • • • • • • • • • • Neisseria meningitidis(23) Streptococcus pneumoniae(20), Streptococcus uberis(12), Salmonella Enteritidis(10), Salmonella enterica(5,35), Listeria monocytogenes(28,29,39), Legionella pneumophila(33), Clostridium perfringens(37), Leptospira interrogan(38,38), Escherichia coli O157:H7(30,46), Clostridium difficile(43), Burkholderia pseudomallei(42), Pseudomonas aeruginosa(32), Shigella spp(13) et.al..
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
LN1
GX2
CQ1
GZ2
SC17
SC84
4380032
4380026
RC4716
Gx407
27
28
多种重复模式
TR2
Indices 217182--217298 217182--217291 217221--217313 Period Size 24 15 39 Copy Number 4.5 8.1 2.4 Consensus Size 24 14 39 Percent Matches 61 57 94 Percent Indels 18 18 1 Score 96 77 171 A 27 27 25 C 16 17 16 G 35 35 34 T 21 20 23 Entropy (0-2) 1.94 1.94 1.95
• 聚类分析 • 构建最小生成树
11
MLVA 实验操作
• • • • • • • • 一、模Байду номын сангаас制备：DNA提取模板或水煮模板 二、PCR 扩增 多重PCR反应 三、扩增条带大小判断： （一）毛细管电泳： 1.引物标记 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带）
VNTR产生的原因：聚合酶的滑链复制
6
VNTR 位点的确定
TRF 软件（Tandem Repeats Finder software）， ://minisatellites.u-psud.fr/
Strain H37Rv: 4 x 15 bp Strain CDC1551: 5 x 15 bp
215 bp
• • • • 多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：VNTR： MLVA方法：即VNTR的数组 例如：
其他特征
MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST