化学生物学论文班级：2009级化学生物学班姓名：冯昊源学号：2009111123酶结构研究的内容概述【摘要】酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂。

绝大多数的酶都是蛋白质。

在酶的作用下，许多生物化学反应过程可以在温和的条件（如温室、常压和水溶液中）下以很高的速度和效率进行。

所以，酶是维持生命体内正常的生理活动和新陈代谢的基本条件。

可以说，没有酶就没有生物体的生理活动和新陈代谢，也就没有生命。

而酶的催化活性是由其结构所决定的，酶结构的研究成为了酶研究的重要内容。

本文通过对酶结构研究的举例，重点介绍酶的1到4级结构的研究内容。

【关键词】酶结构酶结构研究1 引言1.1 酶的概念生物体内不断地进行着各种各样的化学变化。

绿色植物、某些藻类和细菌能够以简单物质（如水、二氧化碳和无机盐）为原料，合成复杂的有机物质。

动物和大多数细菌可以通过摄取外界营养物质，经过分解、氧化、合成等过程，为机体提供所需的能量和结构材料。

实际上，所有的生命现象（如生物个体的繁衍、生长、分化、代谢、运动等），都是各种复杂的化学变化的结果。

生物体内进行的所有这些化学变化都由一种特殊的物质，即酶的催化下进行的。

酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂。

绝大多数的酶都是蛋白质。

在酶的作用下，许多生物化学反应过程可以在温和的条件（如温室、常压和水溶液中）下以很高的速度和效率进行。

所以，酶是维持生命体内正常的生理活动和新陈代谢的基本条件。

可以说，没有酶就没有生物体的生理活动和新陈代谢，也就没有生命。

酶和一般的化学催化剂一样，它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。

酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。

所以一般的化学催化理论和规律，同样适用于生物催化体系。

1.2 酶的催化作用特性酶是一类特殊的蛋白质，它在生物体内不仅作为各种复杂生物化学反应的催化剂，而且也作为生物体内不同能量之间转换的中间体。

与一般催化剂相比，酶的催化作用有高度专一性、高度催化效率及其催化活性的可调节性和高度的不稳定性（变性失活）等特点．酶的这些性质使细胞内错综复杂的物质代谢过程能有条不紊地进行，使物质代谢与正常的生理机能互相适应．1.3 酶结构概述酶属生物大分子，分子质量至少在1万以上，大的可达百万。

酶的催化作用有赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整。

若酶分子变性或亚基解聚均可导致酶活性丧失。

一个值得注意的问题是酶所催化的反应物即底物，却大多为小分物质它们的分子质量比酶要小几个数量级。

酶的活性中心只是酶分子中的很小部分，酶蛋白的大部分氨基酸残基并不与底物接触。

组成酶活性中心的氨基酸残基的侧链存在不同的功能基团，如-NH2．-COOH、-SH、-OH和咪唑基等，它们来自酶分子多肽链的不同部位。

有的基团在与底物结合时起结合基团的作用，有的在催化反应中起催化基团的作用。

但有的基团既在结合中起作用，又在催化中起作用，所以常将活性部位的功能基团统称为必需基团。

它们通过多肽链的盘曲折叠，组成一个在酶分子表面、具有三维空间结构的孔穴或裂隙，以容纳进入的底物与之结合并催化底物转变为产物，这个区域即称为酶的活性中心。

而酶活性中心以外的功能集团则在形成并维持酶的空间构象上也是必需的，故称为活性中心以外的必需基团。

对需要辅助因子的酶来说，辅助因子也是活性中心的组成部分。

酶催化反应的特异性实际上决定于酶活性中心的结合基团、催化基团及其空间结构。

已知的酶基本上都是复杂的蛋白质分子。

不同的酶除了具有不同的一级结构外，还具有特殊的空间结构。

酶分子中的肽链通过折叠、螺旋或缠绕形成了酶的活性空间，即酶的活性部位。

随着结构生物学、分子生物学以及各种分析技术研究的飞速发展，许多蛋白质、酶的一级结构、高级结构已经研究清楚。

2 酶结构研究的内容2.1 酶的一级结构大部分酶都是蛋白质，而蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。

酶蛋白的一级结构包括组成酶的多肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。

其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。

蛋白质氨基酸顺序的改变，不仅将影响蛋白质的高级结构，而且将直接影响其生物功能。

2.2 酶的二级结构酶蛋白的二级结构是指肽链骨架相邻区段借助氢键等沿轴向方向建立的规则折叠片与螺旋，它只涉及肽链主链的构象以及链内或链间形成的氢键。

肽链主链的构象是由肽键的特殊结构决定的。

组成肽链的原子都处于同一平面。

在肽链中，两个相邻的肽键通过一个共同的α-碳原子相连接。

由于Cα—N和Cα—C键可以自由旋转，因此，在保持肽键平面结构不变的条件下，能够形成不同的空间排列。

2.3 酶的三、四级结构酶蛋白的三级结构是指在二级结构基础上肽链进一步的折叠片与盘绕成二维空间结构，多肽链中原来相距较远的序列可以集中到一个区域内。

维系这种特定结构的力主要由氢键、疏水键、离子键和范德华力等。

尤其是疏水键，在酶蛋白的三级结构中起着重要作用。

此基础上，由几个到十数个亚基（或单体）组成的寡聚酶或生物大分子称为酶的四级结构。

3 酶结构研究的方法3.1 一级结构的研究方法蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。

蛋白质一级结构的测定是一项非常复杂的工作。

研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构——氨基酸算起，已有150年的悠久历史，直到1955年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。

这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。

目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。

对此之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸迅速。

但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气相色谱、质谱(GC、MS)等方法的相继出现。

使结构分析的速度也显著加快。

一级结构的测定方法可概述如下：：（1）测定蛋白质氨基酸残基组成，根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨基酸数量。

（2）测定蛋白质分子中多肽链的数目。

通过测定末端氨基酸残基的物质的量与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

（3）二硫键的断裂及多肽的拆分。

由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。

可通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。

（4）多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺序的测定。

一般用酶或溴化氰选择性降解多肽链，产生的肽段用酸水解法完全水解多肽，测定并计算出各种氨基酸的分子比，用Edman降解法分析各肽段的氨基酸顺序。

（5）利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解得到的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序，并确定多肽链中二硫键的位置。

3.2 二级结构的研究方法蛋白质二级结构的测定主要通过圆二性色谱（Circular Dichroism，CD）和傅立叶红外光谱法（FT-IR）进行。

CD测定蛋白质二级结构的基础是蛋白质的手性，蛋白质的二级结构（alpha螺旋、beta折叠）是手性的，蛋白质侧链也是具有手性的。

CD是一种可以定量检测分子结构手性，提供蛋白质二级和三级结构的独特光学技术。

我们应该了解的是CD的结果判断：1）alpha螺旋：192nm处，有一个强的正向峰；222nm 和208nm处有两个负向峰，二者峰值接近；2）beta折叠：单一的位于217nm的负向峰；3）无规则卷曲：197nm处一个强的负向峰，217nm处一个小的正向峰。

FT-IR技术用于蛋白质结构的研究具有一些明显的优点:1)所需材料少、不受分子量大小的影响; 2)适合各种状态的样品;3)不受光散射，荧光的影响;4)适合各种不同环境;5)易测定蛋白质的瞬间结构特征，以说明蛋白质在生理状态下结构与功能的关系;6)操作简便，测量速度快。

很多时候我们还是通过预测的方式来初步判断蛋白质结构。

当然这种结构预测的准确性较低，最高在70%左右。

二级结构的预测方法包括：（1）Chou-Fasman算法（2）GOR算法（3）基于神经网络的序列预测（4）基于已有知识的预测方法（包括Lim 和 Cohen 两种方法）（5）同源性比较方法（6）混合方法3.1 三、四级结构的研究方法现阶段测定蛋白质三维结构的方法主要有X射线晶体衍射分析，电镜三维重构技术以及核磁共振技术。

这三种方法因其各自的优缺点适用于不同生物分子的结构。

此外应用较多的还有圆二色谱和电子顺磁共振技术，但是这两种技术不能直接测定蛋白质结构，所以主要应用与测定蛋白质是否发生构象变化。

而四级结构的测定方法包括复合物质量直接分析法（分析性超速离心法、质谱法）、复合物大小直接分析法（分子排阻色谱法、静态光散射法）以及复合物大小间接分析法（分析性超速离心法、动态光散射法、荧光各向异性度测量法）。

4 甾醇14α-去甲基化酶的研究甾醇14α-去甲基化酶是细胞色素P450超家族蛋白质一个成员，是唯一的广泛存在于细菌、真菌、植物和动物中的细胞色素P450蛋白。

CYP51是麦角甾醇生物合成途径的限速酶，催化甾醇前体14α-甲基羟基化反应。

大多数甾醇如胆固醇(动物)、麦角甾醇(真菌)和谷甾醇(植物)都是质膜的组分，甾醇的缺乏导致膜结构和功能消失，故CYP51作为生物甾醇合成过程中的一个关键酶，成为降解胆固醇药物、抗真菌药物和除草剂作用的重要靶标酶。

14α-去甲基化酶抑制剂(DMIs)类杀菌剂即是作用于甾醇14α-去甲基化酶。

因此，CYP51及其基因是农业研究中热点主题。

CYP51是单加氧酶，在生物体甾醇合成途径中催化甾醇前体14α-甲基羟基化反应（图1）。

该过程包括3步，每一步都需要一分子氧和一分子NADPH。

前2步遵循细胞色素P450超家族蛋白单氧化循环通式，14α-甲基依次被单氧化成14α-羟甲基、14α-醛基，最后一步14α-醛基以甲酸形式释放，并生成Δ14，15双键。

C-C键的断裂比较复杂，已经提出2种可能的机制(自由基反应或离子反应)。

图1 CYP51介导的甾醇14α-去甲基反应CYP51具有底物特异性。

到目前为止发现CYP51有5种天然底物（图2），包括羊毛甾醇，24，25-二氢羊毛甾醇、24(28)-亚甲基-24，25-二氢羊毛甾醇、钝叶醇、4β-去甲基羊毛甾醇。

生物界中已知的大多数CYP51对于四种底物均能作用，但不同来源的CYP5l对底物有选择性。

在高等植物中，CYP5l的底物是钝叶醇；在哺乳动物中，其底物是羊毛甾醇和24，25-二氢羊毛甾醇；在真菌中，啤酒酵母等少数酵母菌底物是羊毛甾醇，在其余大部分真菌中(如白色念珠菌、新型隐球菌等)底物是24(28)-亚甲基-24，25-二氢羊毛甾醇，细菌CYP51的天然底物还不清楚。