酵母蔗糖酶的分离纯化（浙江工业大学药学院药学1002+工商管理浙江杭州310014）摘要：本实验采取菌体自溶的方法来破碎细胞壁后经菌体分离提取蔗糖酶液，再在适宜条件下进行热提取，醇提取的方法进行初步提纯。
然后采用例子交换柱的对初提取液进行纯化，讨论该方法相较于其他的有哪些优缺点，及实验中的重要步骤。
用DNS方法对每步提取后的溶液进行酶活力测定，对比其活力大小。
然后利用凯式定氮发及Folin-酚法对每步提取液的蛋白质量，比活力进行测定，对比两种方法各有哪些方面的优势及劣势，并确定最简单有效地蛋白质测定方法。
掌握蛋白质标准曲线制定的关键方法。
最后，采用SDS凝胶电泳测定蛋白质的分子量。
并与其他测点蛋白质分子量测定法分析比较，分析利弊，并提出改进的方法。
结合以上每步实验，总结实验过程中提取纯化时的关键步骤及相关问题讨论。
实验确定蔗糖酶的最适PH值等于5，最适温度为35度，（待修改）关键词：蔗糖酶提取纯化酶活力蛋白质含量1.文献综述蔗糖酶蔗糖酶(Sucrose，EC 3．2，l_26) 又称转化酶(Invertase)。
1828年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在。
蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，所以甜度增加。
按水解蔗糖的方式，切开蔗糖的B—D一呋哺果还原力增加，又由于生成蔗糖酶可分为从果糖末端EC 3 2．1，2o3 和从葡萄糖末端切开蔗糖的—D一葡萄糖。
苷酶( — uc呻 d丑se EC 3．2．1，20)。
前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中,工业上多从酵母中提取。
蔗糖酶的提取及性质研究经过提取，提纯，酶活力测定，比活力，蛋白质含量及相对分子量测定，不同的实验方法对结果又较大的影响。
1.1 蔗糖酶的提取现阶段主要存在甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法三种方法。
不同的提取方法的提纯环境的要求不同，且提纯效果有一定的差异。
不同提取方法的比较如下：表1 不同蔗糖酶提取方法比较蔗糖酶提取方法提取液酶活性实验优点实验缺陷甲苯自溶法偏低试剂简单、价格低廉其耗时长、重复性差、酶活性低冻融法一般，是甲苯自溶的534倍。
可以确定提取蔗糖酶的最佳条件耗时长，操作繁杂。
SDS抽提法最好，是甲苯自溶的1120倍。
操作简便易行、生产成本低、回收率高受浓度影响加大。
容易引入杂蛋白质从表中可看出,SDS 抽提法的酶活性最高, 冻融法次之, 常规的甲苯自溶法酶活性最低。
所以，一般情况下，为保证酶的产率和活性会选择SDS法进行蔗糖酶的提取，且由于操作简单，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取[1]但实验室为保证低成本，有时也会采用甲苯自溶法。
1.2蔗糖酶的提纯1.2.1 常见的蛋白质的纯化方法不同形式的纯化方法：（1）根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤子不能通过半透，密度梯度离心；凝胶过滤。
（2）利用溶解度差别分离：等电点沉淀法。
盐溶与盐析（3）根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离。
（4）蛋白质的选择吸附分离（5）根据配体特性的分离——亲和层析（6) 低温有机溶剂沉淀法: 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出。
1.2.2 主要方法简介与比较现在常用的分离方法又：（1）离子交换柱法：以离子交换剂作为柱填充物，在中性条件下，根据由于蛋白质和多肽的带电性不同而引起的离子交换亲和力的不同而得到分离。
该方法是目前最常用的方法，就有很高的纯化效果，曾成功地从盐源山蛭(Haemendipsa yunlyuanensis)头部分离纯化了抗凝血多肽[2].。
（2）电泳法：酶蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离活力的测定。
且在得出双向凝胶电泳的效果在电泳方法中最好[3].。
（3）蛋白质盐析：当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。
一般粗提物中常用此方法。
（4）有机溶剂沉淀：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中便沉淀析出。
该方法经常用于酶的提纯[4] 。
（5）等电点法：利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质具有不同的等电点的特点进行分离的方法。
用于提取后去除杂蛋白，通过变动提取液的pH使某些与待提纯的蛋白质等电点相距较大的杂蛋白从溶液中沉出。
但此法很少单独使用，可与盐析法结合使[5] 。
目前，除上述技术外，如移动界面电泳，各种形式的区带电泳，特别是圆盘凝胶电泳、毛细管电泳以及等电聚焦点用等均具有很高的分辨率，可用于蛋白质的分离纯化。
纤维素离子交换剂和Sephadex离子交换剂的离子交换层析，HPLC和亲和层析法都是有效的分离纯化方法。
1.3酶活力的测定1.3.1 常见的酶活力测定的方法目前常用的还原法有：DNS法、福林法，砷钼酸盐法、酚硫酸法和地衣酚法。
除此之外还有色原底物法、粘度法、HPLC法（高压液相色谱法）、免疫学方法、琼脂凝胶扩散法等。
1．3.2 几种酶活测定方法的比较本实验采用DNS法来测定酶活性，因为其操作相对简便，试剂也较廉价，便于获得，反应显现较明显，便于通过测量吸光度来换算其酶活，不过需要先绘制标准曲线，在进行吸光度测定过程中，若超出一定范围则需改变取样量，重新操作，相对繁琐一些。
但若测定大量的酶的活力，较常采用的是，福林法和IVU 法。
这两种方法，福林法的反应时间较短(10rain)，但步骤较多且烦琐，由于液体的取用量较小，反应时间短，容易造成平行试样间的误差。
I VU法反应时间长(60min)，反应时间控制带来的测定误差较小，在其关键滴定操作中，平行试样间结果相差小，可信度高。
因此，两种方法均可作为常用蛋白酶活力的检测，但福林法快速，更适合大量酶活力测定[6]。
1.4蛋白质总量测定1.4.1 常用的蛋白质测定方法目前常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford)。
其中Bradford法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。
1.4.2 常用蛋白质测定方法比较分析凯氏定氮法：该法适用范围广泛，测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时，试剂消耗量，若采用模块式消化炉代替传统的消化装置, 可同时测定几份样品，节省时间,提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点[7]。
双缩脲法：该法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,不受温度的影响。
可快速测定蛋白质含量，试剂单一,方法简便，但灵敏度差，测定范围为1～20 mg 蛋白质。
适用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定[8]。
紫外吸收法：此方法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。
特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,缺点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质[9]。
考马斯亮蓝：该法方法简便,易于操作,所用试剂较少,显色剂易于配制。
干扰物质少,如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色。
此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。
该方法适用于要求灵敏度高、快速定量测定微量蛋白质的测定[10]。
以下图表为以上方法的对比分析总结：1.5 蔗糖酶相对分子质量的测定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质质量是最常用的方法，尤其适用于相对分子质量在10000-100000的蛋白质，是一种检测蛋白纯度、评估蛋白质分子量的生化分析方法. 电泳后的凝胶可以通过多种染色法对蛋白质进行检测, 最常用的是考马斯亮蓝( Coomassie br il liant blue, CBB)染色法[1 1] .此法具有特异性强、操作简单及干扰因素少等优点. 因为凝胶中存在SDS, SDS 的存在干扰了考马斯亮蓝与蛋白质的结合.过去电泳后的凝胶采用含甲醇的染色液和脱色液. 甲醇是一种无色、透明、易燃、易挥发的有毒液体, 经人体代谢产生甲醛和甲酸甲酸会累积在眼睛部位, 破坏视觉神经细胞, 产生永久性损害. 甲酸进入血液后, 会使组织酸性越来越强, 损害人体肾脏, 导致肾衰竭[ 12] . 而对凝胶染色脱色过程不可避免会泄漏一定数量的甲醇, 这会使操作人员的健康受到损害.而目前使用的方法中，采用乙醇来代替甲醇的方法染色。
电泳后, 先用固定液( 冰醋酸- 乙醇体系) SDS-PAGE 凝胶进行处理,使考马斯亮蓝染色得以顺利进行. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进使得染色与脱色的时间远低于传统的染色与脱色的时间，而且由于完全不使用甲醇,降低了成本, 有利于操作人员的身体健康, 改进后的方法优于传统的方法.【13】2实验材料与方法2.1 蔗糖酶的提取与粗提纯2.1.1 材料啤酒酵母2.1.2试剂醋酸钠（AR），甲苯，4mol/L醋酸，95%乙醇，0.5mol/L Tris-HCl PH=7.3缓冲液，0.05mol/L Tris-HCl PH=7.3缓冲液2.1.3 仪器恒温水浴锅，恒温培养箱，高速冷冻离心机，磁力搅拌器或梯度混合器，搅拌子，吸球、玻璃棒、滴管、PH试纸，具塞试管10mL*3，烧杯100mL*1、1000 mL*1，量筒10mL*1、25mL*1，锥形瓶250mL*1、50mL*12..1.4 方法通过甲苯自溶法在37℃培养箱中保温60h进行自溶，获得粗提取液，对粗提取液进行离心，获得初提液A，加4mol/L的醋酸3.2ml左右,在50℃恒温水浴30min获得热提取液B,冰浴中缓慢加入95%乙醇溶液沉淀，用Tris-HCl溶解得乙醇提取液C。
保存A,B液各3ml及全部C液用于后续实验。
2.1.5 数据处理公式VA总=VAVB总=VB·[VA/（VA-3）]VC总=VC·[VA/（VA-3）]·[VB/（VB-3）]=VC·[VB总/（VB-3）]2.2 蔗糖酶的纯化2.2.1 材料0.5mol/L Tris-HCl PH=7.3缓冲液，1mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl PH=7.3缓冲液，0.5mol/L NaOH，Q sepharose2.2.2 仪器层析柱、梯度发生器及搅拌子、紫外分光光度计、点滴板等2.2.3 操作方法本实验通过以琼脂作为不溶性母体，以Tris-HCl 缓冲液调其PH=7.3，使一般蛋白质显负电性，吸附在交换剂上，后用Tris-HCl 及NaCl缓冲液的混合梯度剂，通过逐级增加氯离子浓度来逐级洗脱，并测各组吸光值（反应蛋白含量多少）。