dNTP呈颗粒 状，-20°C 保存
小量分装 -20℃冰冻 保存
反应中，dNTP 应为50～200umol/L
1M NaOH或 1M Tris.HCL 将PH调节 到7.0～7.5
dNTP质量 与浓度
DNA 纯化
模板 核酸
RNA 纯化
SDS
蛋白酶K
溶解细胞膜 解离核蛋白 与蛋白结合成沉淀
水解消化蛋白 质 （组蛋白）
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2011
靶序列或扩增产 物的交叉污染
选择的扩增序列 与非目的扩增序
列有同源性
靶序列太 短或引物
太短
整个基因组或 大片段的交叉
污染
空气中的 小片段核 酸污染
高压消 毒
耗材一 次性使
用
巢式 PCR
污染解决 方法
操作时应 小心轻柔
紫外照射
引物与靶序列不完 全互补、 或引
物聚合形成二聚体
Mg2+离子浓度过高 退火温度过低
PCR基本原理及注意事项
目录
基本原理
反应体系
常见问题
基本原理：
变性
退火
模板DNA经加热变 性成单链后，温度 降至55℃左右，引 物与模板DNA单链 的互补序列配对结 合
模板DNA经加热至 93℃左右一定时间 后，使模板DNA双 链或经PCR扩增形 成的双TaqDNA聚合酶的作用下 ，以dNTP为反应原料， 靶序列为模板，按碱基 配对与半保留复制原理 ，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复 制链
PCR循环次数过多
酶的质和量
出现非特异 性扩增带
重新设计 引物
解决方法
减低酶量 或调换
另一来源 的酶
降低引物量， 适当增加模 板量，减少 循环次数
适当提高 退火温度 或用二温
度点法
酶量 过多 或酶 的质 量差
dNTP Mg2+ 浓度 浓度 过高 过高
退火 温度 过低
循环 次数 过多
出现片状拖带或 涂抹带
G C含量以40-60%为宜 ATGC随机分布
避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补
引物 设计
引物3’端的碱基严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基
有或能加上合适的酶切位点 与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性
酶及其浓度
栖热水生杆菌 天然酶
大肠菌合成基 因工程酶
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)
反应体系
10×扩增缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶
Mg2 加双或三蒸水至
10ul 200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L 100ul
PCR反应
引物
Mg2
酶
五要素
模板
dNTP
扩增跨度 以200-500bp为宜
15-30bp
异硫氰酸胍或 蛋白酶K法
Mg2浓度
dNTP浓度为200umol/L时， Mg2 浓度为1.5～2.0mmol/L为宜
浓度过高，反应特异性降低， 出现非特异扩增
浓度过低会降低Taq DNA聚 合酶的活性，使反应产物减少
常见问题
假阳性
出现非特 异性扩增
带
出现片状 拖带或涂
抹带
假阳性
引物设计不 合适