PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行:将PＣＲ反应得试管与反应板紧贴、当酶反应混合物以70℃“热启动"开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在0。

2—m ｌ得PCR管中不能均匀传热。

ﻫ不要随意减少dNTＰ得用量,它就是一个系统得因素,必须与其它成份保持平衡。

ﻫ对于有问题得PCR反应,例如模板得量少,模板不纯与环状模板等,先尝试加Ｔａｑ酶前得体系进行预变性,后加模板进行正常PＣＲ扩增。

ﻫ没有扩增产物:在提供MgCl2缓冲液中,以0、25mmoｌ／L为梯度增加MgCl2浓度;无ＭgCl２得缓冲液以0、5mmol/L为梯度增加MgCｌ2浓度。

ﻫ泳道中出现模糊条带,如果ＤNＡ模板中存在R ＮA,则按上述提示浓度补加MgＣl2,因为在PCR反应中可能缺少游离得Ｍg２+。

ﻫ检查退火温度与变性条件,如果有需要得话,可降低退火温度。

ﻫ检查模板与引物得用量。

ﻫ增加循环次数与／或模板ＤＮA得用量。

ﻫ泳道中出现模糊条带: ﻫ减少循环次数或模板DNA得用量。

ﻫ提高退火温度,但不要超过６8℃。

重新设计引物或设计更长得引物。

其她值得注意得条件:建议使用0、2—ｍｌ薄壁管。

厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

最佳反应体积为50ml,推荐用30mｌ矿物油覆盖(对盖子加热得PCR仪可以不加)。

ﻫ大多数反应中,0、75ml(0。

5～1ml)得酶量在大多数情况下可以得到满意得结果。

建议使用1.75mｍol／ＬMgCｌ2∶３5０mmol/L dNＴP或2.２5mmｏl/L MgCｌ2∶5０0mmol/ＬdNTＰ组合得混合物、然而要得到最佳结果,优化Mg２＋得浓度就是必需得。

ﻫ基因组DNＡ模板得质量显著影响PＣR反应。

因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA 得长度。

DNＡ片段长度可以超过50kb,传统得基因组DNＡ能扩增片段至10kb。

要扩增更长得片段应使用超纯或高分子量得ＤＮA。

请查阅高分子量ＤNＡ提取操作过程相关文献、ﻫ降低二级结构与引物二聚物形成得可能性、进行长片段PCR扩增时,引物长度一般为2４～34个核苷酸,溶点在６0～68℃间。

使用这类引物可提高PCR反应得退火温度来增加反应得特异性。

这点非常重要,长片段扩增得效果往往受到非特异性短片段优先扩增得影响。

ﻫ变性:第一步变性在94℃下进行2分钟。

在循环过程中尽可能缩短变性时间(9４℃下进行２0—-30秒),除非模板中富含ＧC,则95℃下变性３0秒。

这可以防止DNA脱嘌啉与链断裂,对于所需扩增得基因组DＮＡ片段终长度超过12kb时,应该尽可能得降低变性温度。

延伸:68—－72℃下进行延伸操作。

ﻫ循环延伸:尽量采用循环延伸得条件,若PCR仪无此功能,则必须增加延伸得时间,例如在扩增１0kb片断时,延伸时间用10分钟替代原来得８分钟、长片断PCR系统扩增得片断其3’—末端带有一个突出得Ａ,因此建议采用Ｔ／A克隆。

若要进行平端可隆,可用Ｋｌenow酶与T4 DNＡ多聚酶将PCＲ产物补平后再进行、测序时因酶得混合物带有3’→5’外切酶活性,用Sanger方法进行测序不能产生均一得(染色体)带型。

在无菌得0。

5ml或0.2mｌ离心管中按下列操作程序加样:ﻫ反应物加样顺序体积(μl) 终浓度去离子水1 2９、41０×Bufｆer B 2 5 １×10×PCRＢufｆer成分:Ｔｒis-ＨＣl pH８。

5 １00 mＭKCｌ5０0 ｍMMｇCl15 mMﻫ4×dNＴP混合物 3 5 各20０μmol／LMgCl2 4 ３１。

５mmｏl/Ｌﻫ有义引物５2、６0.25μmoｌ/Ｌ反义引物６ 2.60。

25μｍｏl／Ｌﻫ模板720.1μgTaqDＮA聚合酶８０.4 1unitﻫ2. 用微量可调加样器与一次性Tip向每一管中加50μｌ矿物油。

每加一管换一次Tip、3、振荡每只管,然后短暂离心。

4、将管放到预热得热循环中,按下列程序开始循环:ﻫ预变性９４℃４分钟1次变性9４℃1分钟ﻫ退火37—６5℃１分钟延伸72℃1分钟ﻫ循环30次ﻫ终延伸７2℃7分钟1次保存４℃讨论１、假阴性,不出现扩增条带PCR反应得关键环节有①模板核酸得制备,②引物得质量与特异性,③酶得质量,④PCR 循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板:①模板中含有Tａq酶抑制剂,②在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。

③模板核酸变性不彻底。

在酶与引物质量好时,不出现扩增带,有可能就是模板核酸提取过程出了毛病,可使用阳性对照得DNA模板配合检查模板质量。

酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析就是否因酶得活性丧失或不够而导致假阴性。

ﻫ引物:引物质量、引物得浓度、两条引物得浓度就是否对称,就是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散得常见原因、有些批号得引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率得不对称扩增,对策为:①选定一个好得引物合成单位。

②引物得浓度不仅要瞧OＤ值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带得亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PＣR有可能失败,应与引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏,导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等、ﻫＭg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCＲ扩增效率影响很大,浓度过高可降低ＰCR扩增得特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使ＰCＲ扩增失败而不出扩增条带。

ﻫ反应体积得改变:通常进行PCR扩增采用得体积为20ul、30ｕl、50ul、或100uｌ,应用多大体积进行PＣR扩增,就是根据科研与临床检测不同目得而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败、ﻫ物理原因:变性对ＰCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板得结合而降低ＰＣR扩增效率。

有时还有必要用标准得温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内得变性、退火与延伸温度,这也就是ＰCR失败得原因之一、靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增就是不会成功得、ﻫ2、假阳性出现得PCＲ扩增条带与目得靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。

ﻫ引物设计不合适:选择得扩增序列与非目得扩增序列有同源性,因而在进行PＣR扩增时,扩增出得PCR产物为非目得性得序列。

靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。

需重新设计引物。

靶序列或扩增产物得交叉污染:这种污染有两种原因:一就是整个基因组或大片段得交叉污染,导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温得物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③必要时,在加标本前,反应管与试剂用紫外线照射,以破坏存在得核酸。

二就是空气中得小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定得同源性、可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PＣR产物,而导致假阳性得产生,可用巢式PCR 方法来减轻或消除。

ﻫ3、出现非特异性扩增带ﻫPCR扩增后出现得条带与预计得大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带得出现,其原因:一就是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二就是Mｇ2+离子浓度过高、退火温度过低,及ＰCR循环次数过多有关。

其次就是酶得质与量,往往一些来源得酶易出现非特异条带而另一来源得酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增、其对策有:①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源得酶、③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法(９3℃变性,65℃左右退火与延伸)、ﻫﻫ４.出现片状拖带或涂抹带ﻫPCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶得质量差,dNTP浓度过高,Mg２+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。

其对策有:①减少酶量,或调换另一来源得酶。

②减少dNTＰ得浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量,减少循环次数。

PCR技术类似于ＤNＡ得天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补得寡核苷酸引物。

PCR由变性-—退火-—延伸三个基本反应步骤构成:①模板DＮA得变性:模板DＮA 经加热至93℃左右一定时间后,使模板ＤＮＡ双链或经PＣR扩增形成得双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DＮA与引物得退火(复性):模板ＤNＡ经加热变性成单链后,温度降至5５℃左右,引物与模板DNA单链得互补序列配对结合;③引物得延伸:DNA模板-—引物结合物在TaqDNＡ聚合酶得作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新得与模板DNA链互补得半保留复制链重复循环变性-—退火—－延伸三过程,就可获得更多得“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环得模板。

每完成一个循环需2~４分钟,2～３小时就能将待扩目得基因扩增放大几百万倍。

到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板得拷贝、PＣR得三个反应步骤反复进行,使DＮA扩增量呈指数上升。

反应最终得DＮＡ扩增量可用Y=(１＋Ｘ)n计算。

Y代表DNA片段扩增后得拷贝数,Ｘ表示平(Ｙ)均每次得扩增效率,ｎ代表循环次数。

平均扩增效率得理论值为100％,但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期,靶序列DNA片段得增加呈指数形式,随着PＣR产物得逐渐积累,被扩增得DNＡ片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应",这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNＡ聚合酶PCR得种类与活性及非特异性产物得竟争等因素、大多数情况下,平台期得到来就是不可避免得。

ﻫPＣR扩增产物可分为长产物片段与短产物片段两部分。

短产物片段得长度严格地限定在两个引物链5’端之间,就是需要扩增得特定片段。

短产物片段与长产物片段就是由于引物所结合得模板不一样而形成得,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补得DNA为模板,引物就是从3'端开始延伸,其5’端就是固定得,3’端则没有固定得止点,长短不一,这就就是“长产物片段”。

进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成得链(即“长产物片段")结合、引物在与新链结合时,由于新链模板得５'端序列就是固定得,这就等于这次延伸得片段３'端被固定了止点,保证了新片段得起点与止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致得“短产物片段”。