遗传育种与生物合成文章编号:1001-8689(2007)07-0403-02青霉素高产菌株的理性筛选娄忻　张莉　刘靓　张玉莲　陈丽华　刘静　贺建功(华北制药集团新药研究开发有限责任公司　微生物药物国家工程研究中心,　石家庄050015) 摘要:　以青霉素生产菌种87117#为出发菌种,采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法,结合限氧条件下的摇瓶筛选,从177支前体抗性株中筛出XY -137#高产突变株。

该菌株摇瓶效价平均提高了8.8%,且遗传特性稳定,单位菌丝产物合成能力强。

XY -137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证,其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。

关键词:　紫外诱变;　动态后处理;　理性筛选;　青霉素高产菌株中图分类号:T Q 465.1 文献标识码:ARational screening of penicillin high producing strainLo u Xin,　Zhang Li,　Liu Liang,　Zhang Yu-lian,　Chen Li-hua,　Liu Jing and H e Jian-g ong(N ew Dr ug R&D Co.,L td of N or th China Phar macentical Co rp.,N ational Eng ineering Resear ch Center of M icro bial M edicine ,　Shijiazhuang 050015) ABSTRACT U sing Penicillium chry sogenum #87117as starting strain ,a penicillin high yield str ain #XY-137w as obtained by U V irr adiation com bined w ith precurso r-resistant strain in shake flask selection metho d under lim ited o xyg en.Penicillin potency of strain #XY-137w as increased by 8.8%cultured in shaking flasks.Average pr oductivity o f about 100batches ferm entation level w as increased by 2.69%～5.66%than that of strain #87117in 100-ton ferm entor .KEY WORDS U V m utagenesis;　Dynamic po st-treatment;　Rational screening ;　Penicillin high-pr oducing strain收稿日期:2007-03-15 修回日期:2007-05-08作者简介:娄忻,女,生于1963年,高级工程师。

主要从事微生物药物产生菌的遗传育种研究。

由于青霉素原料的后加工与半合成领域愈来愈广泛,世界青霉素市场竞争十分激烈。

生产厂家唯有不断地提高生产水平,降低生产成本以增强企业的竞争力,而优质高产菌种的选育和应用是其中的基础和关键。

随着青霉素菌种生产能力的提高,传统育种方法的局限性越来越明显。

理性化筛选是应用遗传学和生物化学的原理,根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构,设计筛选方法,定向选出有效的性状突变株。

我们依据理性育种的理念,参照现有生产条件设立基本筛选模型,采用紫外辐射震动工业生产菌种稳定的遗传结构,再辅以限氧条件下耐前体突变株的筛选,达到选育高产菌株的目的。

1　材料与方法1.1　出发菌种　青霉素生产菌种P enicillium chry sogenum 87117#。

1.2　培养基(1)分离及斜面培养基　蔗糖、甘油、酵母粉、NaCl 、CaSO 4、微量元素、琼脂。

(2)种子培养基　以蔗糖、玉米浆为碳、氮源。

(3)发酵培养基　以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源,加无机盐类组成。

1.3　菌种诱变与筛选(1)紫外诱变　将出发菌株的单孢子悬液置紫外灯下40cm 处照射90s 。

(2)前体动态后处理　定量吸取经过紫外线照射后的孢子液,分别加入含有不同剂量的前体(苯乙酸胺)的种子培养基试管中,使每支试管的前体终浓度在0～4.8%之间。

将上述试管置25℃恒温振荡培养18h 左右,然后稀释分离在固体培养基平板上。

(3)前体抗性菌落检出　平板置25℃恒温培养・403・中国抗生素杂志2007年7月第32卷第7期8d 。

从耐受不同浓度前体处理后长出的抗性菌落中挑选孢子相对丰富、组织比较致密的菌落进行斜面传代培养,以备摇瓶筛选。

(4)摇瓶定向筛选低氧耗、低菌丝量的高产菌株　将摇瓶机转速由通常的220r /m in 降至160r /m in ,在低通气条件下进行摇瓶筛选。

后续的高产株特性考察和工艺优化均在此条件下进行。

摇瓶筛选考察指标为发酵效价和菌丝生长量(packed m ycelial v olume ,pm v )。

1.4　样品检测发酵液倒入刻度离心管中,3000r/min 离心10m in 。

取上清液,用美国OI 公司Flow Solution Ⅳ化学自动分析仪检测其中的青霉素效价(u/m l)。

沉淀部分所占体积与发酵液体积的比值即为pmv (%)。

2　结果2.1　XY -137#高产突变株的选育出发菌株87117#先经过两次自然选育,然后采用紫外线复合前体动态后处理,挑取177支抗性株,在限氧条件下进行摇瓶筛选。

于3.84%前体耐受浓度下获得XY -137#高产突变株,以87117#为对照,其5d 和7d 摇瓶相对效价分别为107.4%和110.3%,摇瓶效价平均提高了8.8%。

2.2　XY -137#菌株特性考察(1)菌种纯度　XY-137#菌株自然分离后正常型菌落达96.3%,符合上生产罐的要求。

(2)斜面周期　XY -137#与出发菌株相比其斜面外观有所改变,孢子长势较弱,颜色明显变浅。

若仍按原周期培养斜面,则种子瓶的培养时间需延长4～6h 。

经过试验比较,将斜面培养周期推后1d,种子瓶生长正常,且摇瓶前期发酵效价略有提高。

(3)单位菌丝产物合成能力　由图1可知,与出发菌种相比XY-137#菌株的摇瓶效价有显著提高,而菌丝量较低,说明XY-137#菌株单位菌丝产量明显优于87117#对照菌种。

1:87117#相对效价;　2:XY -137#相对效价;3:87117#菌丝生长量;　4:XY-137#菌丝生长量图1 XY -137#与87117#菌种摇瓶相对效价和菌丝量比较 (4)稳定性试验　XY -137#菌株经斜面传代后进行摇瓶考察,F 1～F 4代相对效价依次为100%、98.9%、101.1%和99.7%,证明其稳定性良好。

2.3　XY -137#菌株摇瓶工艺优化(1)培养基改良　进行了多轮均匀设计试验。

种子瓶经回归分析得到的最优配方中,减少了质量不易控制的玉米浆加量,增加适量的无机氮源,碳源比例也稍做了增加,优化后种子瓶的菌浓明显增大,发酵效价提高了7.5%。

发酵培养基则基于大罐的用料和配比,尝试添加适量固形有机氮源来稳定摇瓶效价。

经摇瓶发酵试验,在多种有机氮源中最终选择加入少量的麸质粉,摇瓶效价提高了6%左右。

(2)增加前体补入量　考虑到XY-137#系耐前体突变株,故欲增加前体补入量,以满足高产菌株的需要。

结果显示将前体浓度调高3%,补入体积不变,XY-137#菌株摇瓶效价提高了9.4%(表1)。

表1 前体增量试验结果前体浓度　pH 菌丝生长量(%)相对效价(%)对照+3%7.0233109.4对照6.9532100.02.4　XY -137#菌株生产试验XY-137#菌株在100m 3罐中考察其生产能力及对原材料和工艺条件的适应性。

经统计,该菌株放罐95批,在发酵周期短4h 、主要原材料消耗没有增加的情况下,XY-137#菌株的放罐效价、发酵指数、罐批产量比同期87117#菌株分别提高了3.83%、5.66%和2.69%。

上罐试验同时还证实XY-137#菌株不仅具备高产能力,而且发酵液粘度比87117#有所降低,可以减少动力消耗。

3　讨论对于青霉素这样产量已达较高水平的老品种,其产生菌久经人工选育,不论在遗传背景或生理特性方面都发生了复杂的变化。

因此在做进一步诱变育种时,不但要考虑诱变剂的选择,更重要的是对筛选方法作合理的设计,使变异株产量的提高和主要性状的改变能明显地表达出来。

有报道根据青霉素的生物合成途径在固体培养基上加入缬氨酸、6-氨基青霉烷酸、苯乙酸等底物进行抗性筛选[1,2];或采用原生质体融合技术,使两株营养缺陷型菌株融合,筛选融合子[3]均取得了一定的效果。

(下转第446页)・404・青霉素高产菌株的理性筛选　娄忻等种葡萄球菌菌群以凝固酶阴性葡萄球菌在门诊感染方面占有较大的分量。

本文头孢硫脒对138株各种葡萄球菌的敏感率为99.3%,仅次于万古霉素,其抗菌活性明显优于苯唑西林、头孢唑林、头孢曲松、克林霉素、米诺环素、左氧氟沙星、红霉素。

说明头孢硫脒对葡萄球菌有优异的抗菌活性。

耐甲氧西林葡萄球菌是近年来基层门诊、社区医院的重要病原菌,几乎所有的临床标本中都能检出。

本医院门诊检测了138株各种葡萄球菌菌群,M RS的总检出率为50.7%,与梅亚宁等报道的56%[3]相同,其中凝固酶阴性葡萄球菌在M RS中所占比例最大,达到95.7%,而其中又有表葡菌所占的比例最大(32.86%),这与国内同期文献[4]报告基本相同,应该引起临床医生的足够重视,一定要重视检查,根据检查结果合理、规范使用抗菌药物,预防和减少耐药菌株的产生。

糖肽类抗生素仍然是目前临床上公认的治疗M RS感染首选抗生素[5],且疗效甚佳,几乎没有耐药菌株产生。

本医院门诊检测了头孢硫脒对M RSA和M RCNS的敏感率分别为100%和98.5%,仅次于万古霉素,对M RSA的抗菌活性优于苯唑西林、头孢唑林、头孢曲松、克林霉素、红霉素等,对M RCNS的抗菌活性明显优于苯唑西林、头孢唑林、头孢曲松、克林霉素、米诺环素、左氧氟沙星和红霉素。

因此,头孢硫脒对M RSA和M RCNS的作用仅次于万古霉素,与杜梅等的报道相符[6]。

头孢硫脒是我国自行研制并首先用于临床的头孢菌素,为半合成头孢菌素类抗生素,属第一代头孢菌素,它主要作用于细菌的中膈细胞壁,抗菌谱广,抗菌作用强,是强杀菌药,适用于对该药敏感的革兰阳性球菌和部分革兰阴性杆菌所引起的呼吸道感染、创伤及外科感染、皮肤及软组织感染、尿路感染、耳鼻喉感染、心内膜炎和败血症等,尤其适用于金葡菌、表葡菌、链球菌和肠球菌等革兰阳性球菌所引起的各种中、重度感染的治疗[7]。