孝感学院生命科学技术学院实验报告专业：学号：姓名：分数：实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉(1000 g)2．主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20 mL×11 （2）滤纸（3）烧杯：100 mL×2（4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2 mL×2；10 mL×1 （7）恒温水浴锅（8）煤气炉（9）漏斗（10）天平（11）分光光度计3．试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL 容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。

（3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。

（4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。

（5）6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。

（分别取59.19 mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL）四、操作步骤1. 制作葡萄糖标准曲线批阅教师：年月日取7支20 mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1 葡萄糖标准曲线制作管号1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值（OD540nm）002 1.5010.2 1.8 1.50.220.4 1.6 1.50.430.6 1.4 1.50.640.8 1.2 1.50.85 1.0 1.0 1.5 1.06 1.20.8 1.5 1.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，用冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀。

调分光光度计波长至540 nm，用0号管调零点，等后面7~10号管准备好后，测出1～6号管的光密度值。

以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2. 样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取3.00 g食用面粉，放入100 mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50 mL 蒸馏水，搅匀，置于50 ℃恒温水浴中保温20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。

过滤，将滤液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

（2）总糖的水解和提取准确称取1.00 g食用面粉，放入100 mL三角瓶中，加15 mL蒸馏水及10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加热水解30 min, 取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。

如已水解完全，则不呈现蓝色。

水解毕。

冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6 mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100 mL，过滤取滤液10 mL于100 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

（3）显色和比色取4支20 mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。

调波长540 nm，用0号管调零点，测出7～10号管的光密度值。

葡萄糖含量（mg）表2 样品还原糖测定管 号 还原糖待测液（mL ） 总糖待测液（mL ）蒸馏水（mL ） DNS （mL ） 光密度值（OD 540nm ）查曲线葡萄糖量（mg ）平均值7 0.5 1.5 1.5 8 0.51.5 1.5 91 1 1.510111.5五、结果与计算计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量(以葡萄糖计)。

还原糖（%）=查曲线所得葡萄糖毫克数×提取液总体积 测定时取用体积×100 =样品毫克数六、注意1. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。

2. 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。

七、思考题1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl 处理？而在其测定前，又为何要用NaOH 中和？2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设0号管有什么意义？3. 绘制标准曲线的目的是什么？孝感学院生命科学技术学院实验报告专业： 学号： 姓名： 分数：总糖（%）=查曲线所得水解后葡萄糖毫克数×稀释倍数×0.9×100 =样品毫克数实验二油脂酸价的测定一、目的与要求初步掌握测定油脂酸价的原理和方法；了解测定油脂酸价的意义。

二、实验原理油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有刺激性气味，使油脂产生酸价。

酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价或者是酸值来表示。

同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。

酸价是指中和1g油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。

酸价越高，油脂的质量也越差。

三、主要仪器、实验材料和试剂1. 锥形瓶（250 mL）3个；2. 量筒（50 mL）1支；3. 碱式滴定管1支；4. 花生油、菜油、芝麻油等；5. 乙醇-乙醚混合液(1:1,V/V)；6. 0.1 ％KOH（1克KOH溶于1000 mL纯水中）。

四、操作步骤1. 准确称取1~2 g油脂于250 mL锥形瓶中。

2. 在瓶内加入乙醇－乙醚混合液50 mL，充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。

待油样完全溶解后，加入1％酚酞指示剂3～5滴，立即用0.1％KOH标准溶液滴定至溶液成微红色（放置30 S内不褪色）为终点，并记录用去的KOH的体积，并按下式进行计算。

酸价＝2(V2-V1)/WV2 ：滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的毫升数V1 ：滴定空白对照耗用氢氧化钾溶液的毫升数W：油样重(g)注：滴定过程中如出现混浊或分层，表明由碱液带进水过多，乙醇量不足以使乙醚与碱溶液互溶。

一旦出现此现象，可补加乙醇，促使均一相体系的形成。

五、实验结果六、思考题请对你的实验结果进行分析。

批阅教师：年月日孝感学院生命科学技术学院实验报告专业：学号：姓名：分数：实验三蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法)一、目的与要求掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。

二、实验原理大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280 nm波长处。

在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。

三、实验材料、主要仪器和试剂1. 试验材料：萌发3天的小麦种子2. 主要仪器（1）紫外分光光度计，（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管（5）研钵（6）100 mL容量瓶3．试剂：标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/ mL（0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至500 mL）的溶液。

四、操作步骤1．蛋白质（淀粉酶）的提取称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。

将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。

提取液在室温下放置提取15～20 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。

然后在3,000 r/min转速下离心10 min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓度的测定。

2. 标准曲线制作按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。

以光程为1 cm的石英比色杯，在280 nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。

以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。

批阅教师：年月日表1 蛋白质标准曲线制作管号标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/mL）OD280nm104020.5 3.50.1253 1.0 3.00.254 1.5 2.50.3755 2.0 2.00.506 2.5 1.50.6257 3.0 1.00.758 4.00 1.03.样品测定取提取的蛋白质溶液，按上述方法测定280 nm的光密度，并从标准工作曲线上查出提取蛋白质溶液的浓度。

若提取蛋白质溶液的浓度大于2.0，超出测量范围，则稀释后再测，计算蛋白质浓度时乘以稀释倍数。

蛋白质浓度=五、思考题1. 为何要在280 nm波长下测定蛋白质浓度？在其它波长下测定可以吗？2. 如果考虑核酸的存在，蛋白质浓度的实际的值比测量值是大还是小？为什么？孝感学院生命科学技术学院实验报告专业：学号：姓名：分数：实验四淀粉酶活力的测定一、目的与要求学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。

二、实验原理淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。