效作用的研究摘要：【目的】探讨生物杀虫剂Bt毒蛋白的改进措施，以达到使其缩短起效时间的目的，使其能够在应用中更有竞争力，同时印证几丁质酶对于昆虫围食膜的侵蚀作用。

【方法】采用含有几丁质酶的细菌发酵产物对Bt杀虫剂在美国白蛾上的增效作用进行研究。

实验中先单独检验了Bt杀虫剂在美国白蛾上的LC50以及LT50，然后通过复配，获得含有不同浓度发酵产物和Bt杀虫剂的复配剂系列，比较复配后的LC50、LT50与复配前的不同。

【结论】含有几丁质酶的细菌发酵产物对于Bt的LC50的改进效果较弱，但可以较大幅度的改善Bt杀虫剂的LT50，这表明Bt杀虫剂的杀虫速度加快。

The improvement of Bt pesticide on toxicating Hlyphantria cunea by chitinase-containing bacteria fermentation product addition Abstract：[Purpose]To make Bt toxin much more competitive in pesticide selection, chitinase is introduced to act as accelerator of Bt toxin by means of degrading petritrophic membrane. [Method] Bacteria fermentation product is added into Bt pesticide. LC50 and LT50 of Hlyphantria cunea by Bt alone and mixed are separately measured and integratedly analysed. [Conclusion]LC50 improvement by fermentation product adding to Bt is not remarkable, while LT50 is obviously reduced by the addition.关键词：几丁质酶；美国白蛾；Bt杀虫剂；增效；复配Keyword：chitinase；Hlyphantria cunea；Bt pesticide；synergism；formulation效作用的研究1绪论1.1 美国白蛾为害及其防治美国白蛾（Hlyphantria cunea Drury）又名美国灯蛾、秋幕毛虫、秋幕蛾，属鳞翅目，灯蛾科。

是一种世界性的检疫害虫。

主要危害果树、行道树等，幼虫尤以为害阔叶树为重。

对园林树木、农田防护林等造成严重的危害，同时也是城市中主要的树木害虫之一。

该害虫目前已经扩散至华北主要林区，蔓延天津、河北、山东等地，并且呈大发生趋势。

目前已被列入我国首批外来入侵物种。

目前对于美国白蛾防治主要有三种方法。

第一种是手工消灭。

有些城市奖励市民动手抓虫。

这种方法最大的好处是不污染环境，当然，坏处是处理缓慢，而且不能长时间运作。

第二种是化学防治。

主要采用常规针对鳞翅目害虫的化学药剂喷洒防治，能够达到快速杀灭，致死率高的效果，但是对城市环境影响很大，不利于环境保护。

第三种是生物防治，美国白蛾是入侵物种，没有很有效针对的天敌。

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)作为一种生物杀虫剂,已在农业生产中安全地使用了30多年,已经被证明对人和其它动物无害。

它所产生的Bt杀虫蛋白是一种伴孢蛋白，对某一类昆虫有特异的选择性杀伤能力，如Bt棉中所用的杀虫基因，其编码的杀虫蛋白可选择性地毒杀鳞翅目昆虫。

携带Bt基因的工程棉花、水稻等在国外已通过安全性评估，能够用于农业生产。

Bt制剂在田间应用中还存在杀虫谱窄、防效不够稳定、杀虫速度慢的缺点。

与化学农药一样,昆虫对Bt 杀虫剂也发生进化而产生了抗性。

迄今为止，在田间和实验室研究中已经发现有十多种昆虫对Bt杀虫毒蛋白产生了抗性。

因此，提高苏云金杆菌制剂的杀毒效果有着重要的意义。

1.2 Bt杀虫剂作用机理及其可改进点分析Bt杀虫剂的有效成分是苏云金杆菌的芽孢及其伴孢蛋白。

该蛋白在进入昆虫类的胃肠道之后，能够在碱性环境中释放出毒素，使得昆虫自然卷曲，不能进食，进而溶解昆虫肠道壁，使苏云金杆菌芽孢进入血液引起败血症，使昆虫死亡。

整个过程大约需要48小时。

在这一过程中，起决定性的步骤在于芽孢能够穿过肠道进入昆虫血液中。

这需要毒素对于肠道的溶解。

这势必需要毒素对于肠道的直接接触，然而，昆虫肠道中有一到特殊的保护性结构——围食膜，它的主要成分是几丁质，不透水不透气，能够保护肠壁免受食物中坚韧成分的机械性损伤。

同时，该结构也阻挡了Bt中的有效成分穿过肠道壁进入血液。

如果能够人为破坏这一结构，就能够有效的加速Bt的致死过程，当然也能够增强其杀虫效能。

考虑到昆虫围食膜主要由几丁质构成，因此引入几丁质酶可以破坏这一结构。

自然界中，几丁质的分布是很广泛的，因此能够产几丁质酶的微生物也是很容易获得的。

因此实验采用一种产几丁质酶的微生物的发酵产物进行试验，观察能够使Bt杀虫剂效力增强。

早在70年代人们就发现几丁质酶与微生物杀虫剂之间的增效作用。

最早是在林业害虫云杉卷叶蛾上证明微量几丁质酶在大面积森林防治中对于Bt有着明显的辅助效果。

Bt本身产生的几丁质酶及其对杀虫的作用也有相关报道。

如英国学者Sampson在Bt培养液中加入特异的几丁质酶抑制剂,证明Bt对海灰翅夜蛾幼虫的活性明显降低。

Arora等证明在大肠杆菌中克隆表达的某Bt菌株的几丁质酶基因可以显著提高Bt营养期杀虫蛋白的活性。

本文初步探讨了联合使用中病原致病作用变化规律,为病原微生物感染机理的研究和生物杀虫剂的开发提供有益的参考。

2材料与方法2.1 供试菌株与试虫供试美国白蛾为三龄中期幼虫,在26·0±1·0℃、RH30%~40%的微弱光照培养箱中饲养,待测。

采用的菌株是西北农林科技大学提供的菌株Bacillus sp.2.2Bt原液制备市售Bt菌原粉标称活性孢子数109个/g。

准确称取菌粉，以无菌水冲溶配成原液，置于4℃冰箱保存。

2.3 发酵产物制备采用牛肉膏蛋白胨培养基对所选菌株进行扩增培养，分别涂布到10个仅含几丁质碳源的诱导培养基上，选择生长旺盛的菌落，转接入ZX-1型号发酵罐，实际容积为6L，使用几丁质为碳源的精确培养基，一次培养。

2.4预实验2.4.1 Bt杀虫剂LC50的预实验首先准备清水对照。

参考他人文献，考虑到所选用的Bt杀虫剂的孢子计量，考虑进行0——200，每次递增25mg/L的Bt杀虫剂浓度梯度进行预备试验。

实验结果表明，超过50mg/L后，Bt杀虫剂浓度的增加对于杀虫的增加的作用并不明显。

再次预实验表明，本次实验中使用的Bt杀虫剂的LC50可能出现在10mg/L到20mg/L之间。

2.4.2 Bt杀虫剂与发酵产物的复配剂的LC50预实验首先准备清水对照。

按照之前的预实验，认为可以完全仿照进行，于是安排了0——50，每次递增10mg/L Bt杀虫剂的浓度梯度。

对与发酵产物，由于之前的报道讨论过几丁质酶对于Bt 杀虫剂的增幅不会超出常规范围，因此在对预实验结果进行确证后，仅添加了实验中的最高剂量750μl/ml的发酵产物，实验结果表明此时的LC50仍在50mg/L 以下。

2.5 Bt杀虫剂的LC50的测定依据预备试验结果,将Bt配成5个浓度梯度,使溶液中Bt的终浓度为5、10、15、20、25mg/L,每个浓度重复三次，共15个处理。

用15个系列浓度分别感染生长情况相似的15组美国白蛾三龄中期幼虫。

取0.5ml原液均匀涂布于配制好的人工饲料表面,待药水自然阴干后用于饲喂昆虫幼虫，每份饲料喂养试虫50头,接后补充正常饲料。

另外同时有3个清水对照。

投毒24h检查幼虫死亡数,连续观察10d,统计死亡总数,计算累计死亡率。

用SPASS软件计算毒力回归方程、LC50等。

2.6 添加发酵产物的Bt杀虫剂LC50的测定参照预备试验结果,将Bt配成5个系列浓度梯度,再把发酵产物分别加入到这5个稀释液中,使复配剂中Bt的终浓度为5、10、15、20、25mg/L,以发酵产物作为原药，发酵产物在最终药液的浓度为250μl/ml。

同法配制,使复配剂Bt的终浓度同上,发酵产物的终浓度分别为500、750μl/ml,每个重复3次，共45个复配剂处理。

用复配剂分别感染美国白蛾三龄中期幼虫。

感染方法、调查方法和计算方法同2.5。

2.7 发酵产物的毒性测试用不同计量的发酵产物拌喂昆虫，未见昆虫死亡，偶见食欲减退的个体。

因此本文中认为发酵产物单独使用不具有毒性。

2.8速效作用在每一个处理中，获得昆虫死亡曲线，并且找昆虫死亡的最高峰的位置，然后进行比较。

另外使用软件处理数据，得到各自的LT50。

3 实验结果3.1 Bt的致死性试验3.1.1 美国白蛾幼虫感染Bt杀虫剂的病征和病程美国白蛾感染Bt杀虫剂后，开始不呈现任何效果。

在48h前后，呈现明显的Bt杀虫剂致病效果：食欲减退,呆滞少动,体色发暗变黑,躯体失水、缩小。

随后，昆虫虫体极度扭曲变形，并且随后死亡。

复配剂对于美国白蛾的致病没有明显改变，部分昆虫口分泌物和排泄物中有绿色或淡青色汁液，判断为几丁质酶对于肠道的破坏所致。

3.1.2 Bt的总感染力统计10d内每天对Bt感染数进行计数，已经被计数的昆虫转移至另外的培养容器内培养。

从表1可以看出，Bt的LC50约在15ml左右。

表1 Bt杀虫剂感染力统计处理Bt浓度（mg/L）供试虫数（头）解剖镜检感染数感染率5 150 63 42.0%10 150 71 47.3%15 150 79 52.7%20 150 83 55.3%25 150 99 66.0%ck 150 0 03.1.3 Bt杀虫剂的发病高峰期统计发病高峰时可以采用半数致死时间（LT50）来计算，然而根据本次实验的预实验结果，认为实验中样本数较小，如果不能及时统计，即便采用模拟回归的方法计算，也会由于统计过程的不连续性而导致较大的误差。

因此增加了采样的频率，进行了每天3次计数，同时参考采用计算最大死亡速率的方法，在进行回归模拟时辅以非线性模拟的手段，而拟合后寻找增速最大的点作为发病高峰时间。

通过互相参照，认为实验中统计的LT50可信度较高，因此可以采用此数据。

表2中可以看出，发病高峰大约位于5至6天，于经验值相似。

表2 Bt杀虫剂的每日感染力及发病高峰Bt（mg/L）截止每日感染总数LT50（d）1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d5 1 5 11 25 39 55 60 62 62 63 7.7310 2 4 10 26 40 56 64 69 71 71 6.8415 2 8 19 38 52 61 70 76 77 79 6.1320 7 14 29 45 58 71 77 81 82 83 5.3225 4 13 25 38 54 69 84 91 96 99 5.113.2 Bt与发酵产物复配后的杀虫能力提升3.2.1 复配剂对于美国白蛾致死中浓度的测定采用的统计方法于3.1.2相同，通过表3可以看出，复配剂的总感染能力相对于Bt单独作用来说略有增强作用。