Bt（苏云金杆菌）乳剂生产工艺规程
衡阳市微生物厂
一九九二年三月
Bt 乳剂工业生产技术
一、概述
Bt 即苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ）的简称，是一种寄生于昆虫体内引起昆虫发病死亡的能产生伴孢晶体的芽孢杆菌，其制剂广泛应用于农、要、果、蔬、城市园林方面的害虫防治。

二、生产工艺流程
砂土管菌种 斜面菌种 扁
瓶
菌种扩大培养 发酵罐 过滤 浓缩
加助剂 检验 包装
三、生产工艺操作规程 （一）砂土管菌种的制备 1、砂的处理：
取建筑用砂或河砂经60－80目过筛后用工业Hc 浸泡48h 后用清水洗净，再用0.2NNao 中和，烘干后用磁铁除去其中带磁性之金属微粒，装入洁净容器内备用。

2、砂土管制备：
将以上已处理好之砂土分装于1.2×12公分之小试管中，每管约装2克，塞上棉塞，先用2.0kg/cm 2高压灭菌1.5小时，间歇灭菌三次，再以160℃干热灭菌2小时，经无菌试验，即抽取一点砂土置于斜面试管中 36℃培养24小时才检查无杂菌后备用。

27－29℃
48－72h 27－29℃ 18－24h 27－29℃
36－48h
3、砂土孢子的制作：
选择生长良好，经过生产能力考查合格的优良试管斜菌种一支加入无菌水5ml，用接种针刮下孢子制成高浓度的孢子悬液用无菌吸管吸取0.2－0.3ml接入砂土管中，而后置入真空干燥器内，用真空泵间歇抽干，用石蜡封口，以后置于0－5℃冰箱中，在干燥情况下保存。

（二）斜面菌种的制备
1、培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、琼脂2%，调节7.5－8.0溶化后分装试管，加塞放入试管篓内包好灭菌。

2、灭菌：在消毒锅内 1.1kg/cm2下蒸气灭菌30分钟，等冷却到60－70℃时取出摆成斜面，空白培养2天观察无杂菌方可使用。

３、接种培养：将菌种试管斜面放在接种室内或无菌操作箱中，打开紫外线灯灭菌30分钟后关闭。

用接种环按操作规程刮取种子菌苔少许，转至新鲜斜面培养基上划线接种，然后放入30℃培养箱内3－4天，经检查正常，放入冰箱内备用。

（三）扁瓶扩大种子制备
1、培养基：同斜面培养组成，另加葡萄糖1%，溶化后装入扁瓶。

2、灭菌、接种、培养均与斜面菌种同。

（四）发酵
1、培养基棉籽饼粉 3.5%
玉米粉 2.0%
鱼粉 1.0%
酵母粉0.2%
CaCO30.1%
泡敌0.03%
用NoaH调PH8.5 消毒后为7.0左右
2、灭菌：发酵罐在投料之前清洗干净，按投料系数50%投料，分过滤器以2kg/cm2灭菌30分钟，实罐灭菌1.1kg/cm2，罐温121－125℃，保持30分钟（按灭菌操作步骤进行）。

3、孢子悬浮液准备：取培养好的扁瓶种子3－4个分别加入无菌水，将菌苔洗成悬液，再倒入接种瓶内，配上注射针头。

将此孢子悬液进行水浴75℃20分钟处理。

4、接种：通过发酵罐接种孔利用压差将孢子悬液注入发酵罐中。

5、培养：罐压保持0.3－0.5kg/cm2，搅拌220转/分钟，通气量在接种后4小时前小些，逐步增至1：1，温度30℃±1℃。

在上述条件下菌体生长发育经历期为：
0－4小时，调整生长期；
5－12小时，生长繁殖期；
13－20小时，芽孢晶体形成期；
21－放罐，芽孢晶体成熟期。

6、检测：培养过程4、8、12、16、20……各取样检测生长情况、PH 值，最后一次取样进行菌数测定。

（五）发酵液的后处理
1、将发酵好的发酵液用工业盐酸调至PH5.0－6.5。

2、用薄膜浓缩器（或离心机）进行真空浓缩。

3、检测：根据发酵液的含菌数及浓缩倍数估算含菌数100亿/毫升取样检测，化验符合产品质量标准时即可终止浓缩，压入贮罐。

4、添加剂：按规定添加NaCl1%，苯甲酸钠0.3%搅拌均匀。

5、成品检验：
（1）成品经质检部门检验各项指标达产品质量标准后，下达包装通知。

（2）包装：采用1立升塑料瓶包装，瓶有内外盖，不泄漏，包包装应符合产品库存、搬运和运输过程的技术和安全需要，箱内应有产品合格证和使用说明书。

四、Bt乳剂主要生产设备一览表：
附件一：Bt乳剂质量检验方法：
A、Bt乳剂芽孢数的测定：
A1原理
利用血球计数板在光学显微镜下，数出芽孢数，再用公式算出每1
毫升产品中含芽孢数。

A2仪器
血球计数板、光学显微镜等。

A3操作
A3·1晶体处理
将待测样品摇匀后迅速吸取10毫升于等量的0.5N的NaoH溶液中，间歇摇动，处理1－2小时，使晶体全部自溶，直至显微镜检查无晶体为止。

A3·2稀释
在500毫升三角瓶（内装玻璃珠）中，装入99.5毫升无菌水，将经NaoH处理过的样品摇匀后迅速用吸管吸取0.5毫升于三角瓶中（即共稀释400倍）。

A3·3制片
用无菌吸管从充分摇匀的400倍稀释液中吸取少许，从盖玻片的一端注入血球计数板，使菌液沿玻片间渗入，并用滤纸吸干槽中流出多余菌液，操作过程中血球计数板不得产生气泡，否则应重做。

静置15分钟后再计数。

A3·4观察读出芽孢数
制好片后用低倍镜观察，用25×16的计数板，数四个角上的四个中方格和中间的一个中方格的芽孢数，然后再换算成1毫升菌液中的总芽孢数。

A4计算
每1毫升产品中含芽孢数其计算方式如下：
A＝B×C×5×104
式中，A为样品1毫升菌液的芽孢数（亿个/毫升）。

B为五个中方格含芽孢总数。

C为稀释倍数。

5×104为常数即血球计数板每中格体积的含菌数换算成1毫升含菌数。

注：如果用16×25血球计数板计数，则用下面公式进行计算：A＝B×C×3.2×104
B、Bt乳剂和毒效测定：
B1供试虫采集
人工饲养或野外采集（最好在特定区域范围内，同一株植物上收集），龄期一致（一龄或二龄），生长发育良好的健康昆虫（常用菜青虫，但要避免在喷药不久的作物上采取），在室内观察1－2天后备用。

B2一切用具洗净，用1kg/cm2蒸汽灭菌30分钟，备用。

B3操作
B3·1将样品稀释500、1000、1500、2000倍，每个浓度设3个重复。

B3·2用12cm培养皿或罐头瓶作容器，其中放2－3片白菜叶，将菌液涂在菜片上（正、反两面），晾干后放入20－25头二龄菜青虫，同时作一组对照组。

B3·3在27－28℃光照下，饲养试验幼虫。

B4结果记录
试验后24、48、72小时分别观察和记录死活虫数以及虫体化蛹数，并将观察结果列入下表。

Bt乳剂致病率测定记录表
B5计算
根据上表所列数据计算72小时菜青青菜虫死亡率，其计算方法按下
面公式进行：
死亡虫数
死亡率（%）＝×100
供试昆虫
注1：在计算和统计过程中，化蛹虫数不参与死亡率计算。

注2：若对照组死亡率>5%，应校正其死亡率，其校正方法如下：
对照组活虫数－处理组活虫数
校正死亡率（%）＝×100
对照组活虫数
注3：若无菜青虫，可用二龄家蚕代之，检验方法不变。

C、PH值测定：
采用精密PH试纸测定。

附件二：
Bt制剂使用说明书
【简介】本品为高效微生物杀虫剂。

具有对人畜无害，不伤天敌、无污染、价廉等特点。

可广泛使用于农、林、果、蔬、城市园林方面的害虫防治，在建立无公害蔬菜、烟草、茶叶经济作物区上，尤其具有极为良好的推广价值。

实践证明，我厂生产的Bt乳剂，不仅杀虫效果显著，药效期长，而且带来了广泛的社会效益和生产效益。

完全可以取代钾胺磷等部分剧毒农药。

【性状】液剂型（粘稠乳状液体）
【规格】每毫升含孢子数100亿以上，孢子比1：1。

【用途用量】亩用量一般2公两。

兑水低量喷雾。

具体参照下表：。