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嘉兴学院学报
J ou rna l of J iax ing U n iversity
第 19卷第 3期 Vol. 19 No. 3
2007年 2007.
5月 5
微生物基因组 DNA提取方法的比较源自改进刘晓侠 1 , 林建平 2 , 岑沛霖 2
(11嘉兴学院生物与化学工程学院 , 浙江嘉兴 314001; 21浙江大学生物工程研究所 , 浙江杭州 310027)
主要试剂为 10mg /m l溶菌酶 , 20mg /m l蛋白酶 K, 2 ×CTAB (十六氨基三乙基溴化铵 ) 。引物序 列 为 : 5π - ggaattcggatccatggacttcgaggcattt ( B am H I, EcoR I ) , 3π - ttaagcttcctcacgccaccgcacgcgc (H ind III) , 由上海博亚生物技术有限公司合成 。
关键词 : 微生物 ; DNA提取 ; PCR 中图分类号 : Q933 Com par ison and Im provem en t of Extraction M ethods for Genom ic D NA L IU Xiao - xia 1 , L IN J ian - p ing2 , CEN Pei - lin2
Key words: m icroorganism; DNA extraction; PCR ( Polymerase Chain Reaction) 文献标识码 : A1 文章编号 : 1008 - 6781 (2007) 03 - 0048 - 03
1 材料与方法 111 试验材料
黄色短杆菌 (B revibacterium helvolum ATCC11822, G- ) 从北京微生物所购买 ; 放射形土壤杆菌 (Agrobacterium radiobacter ACCC10056, G- ) 从中国菌种保藏中心购买 ; 金黄色葡萄球菌 ( G+ ) , 枯 草芽孢杆菌 ( G+ ) 为本实验室保藏 。 112 试剂及仪器 [ 2 ]
[ 1 ] L iu X1X1, L in J. P. , Q in G. . , Cen P. L. Exp ression of a new hemA Gene from Agrobacterium radiobacter in Escherichia coli for 5 - am inolevulinate p roduction [ J ]. Chinese J. Chem. Eng. , 2005, 13 ( 4) : 522～528. [ 2 ] J. 萨姆布鲁克 , D. W. 拉塞尔. 分子克隆实验指南 [M ]. 北京 : 科学出版社 , 2002 [ 3 ] 乔建军 , 杜连祥. 一种快速有效的枯草芽孢杆菌染色体的提取方法 [ J ]. 生物技术 , 2001, 11 (2) : 38～40 . [ 4 ] 李德葆 , 周雪平 , 许建平 , 何祖华. 基因工程操作技术 [M ]. 上海 : 上海科学技术出版社 , 1996: 1. [ 5 ] F. 奥斯伯 , R. 布特伦 , R. E. 金斯顿. 精编分子生物学 [M ]. 北京 : 北京科学出版社 , 1998: 7. [ 6 ] 刘小勇 , 田素忠 , 秦国夫 , 沈瑞祥. 提取植物和微生物 DNA 的 SDS - CTAB 改进法 [ J ]. 北京林业大学学报 , 1997, 19 ( 3) : 100～103. [ 7 ] 岑沛霖 , 蔡谨. 工业微生物学 [M ]. 北京 : 化学工业出版社 , 2000: 6～40. [ 8 ] 陈颖 , 刘根齐 , 李文彬 , 孙勇如. 三种小球藻 DNA 提取方法的比较 [ J ]. 植物生理学通讯 : 2001, 37 (3) : 242～244.
将以上三种方法提取的 DNA , 通过紫外分光光度计测定它们在 260nm 处和 280nm 的吸光值 , 并 计算它们的比值和 DNA 含量 , 结果见表 1。
方法 溶菌酶法 CTAB 法 超声破碎法
表 1 三种微生物基因组提取方法的纯度和浓度比较
菌种
A260 / A280
DNA产率 ( ng/mL )
仪器有 Lengguang Tech1 Spectrum lab54型分光光度计 , L ITTLE GEN IUS (Japan) 基因扩增仪 。 113 聚合酶链式反应 ( PCR )
PCR 扩增的反应体系为 : 反应总体积 20μl, 含 10pmole引物 , 50ng基因组 DNA , 2μl 10 ×PfuTaq
PCR 扩增的条件 : 95℃预变性 10m in, 95℃变性 30 s, 58℃复性 30 s, 72℃延伸 2m in, 循环扩增 30次 。 114 微生物基因组 DNA 提取方法 11411 溶菌酶法 [ 3 ] 收集对数生长期的菌液 5m l, 置于 10 000 rpm 离心 5m in; 弃上清 , 用 500μl TE 重悬于 115m l离心管中 , 加 10μl 10mg /m l溶菌酶 , 37℃保温 20m in, 再加 215ul 20mg /m l蛋白酶 K混 匀 , 37℃保温 1h; 再加等体积的酚 、氯仿 、异戊醇 (25∶24∶1) , 置于 10 000 rpm 离心 5m in; 取上清 液加 2倍体积的无水乙醇和 1 /10 体积的 NaAc ( pH = 416) , 于 - 20℃下静置 10m in后于 12 000 rpm 离心 10m in; 所得的 DNA 沉 淀 用 70%的 乙 醇 洗 2 次 , 自 然 风 干 后 溶 于 40μl 的 TE (含 20ug /m l RNase) , 55℃处理 15m in, 于 - 20℃保存备用 。 11412 改良的 CTAB[ 4 - 5 ]法 收集对数生长期的菌液 5m l, 置于 10000 rpm 离心 5m in; 弃上清 , 用 500μl TE重悬于 115m l离心管中 , 加 100μl 10% SDS溶液 , 215μl 20mg /m l蛋白酶 K, 37℃保温 1h, 再加 75μl NaC l和 75μl 2 ×CTAB 混匀 , 65℃保温 30m in, 再加等体积的酚 、氯仿 、异戊醇 ( 25 ∶24 ∶ 1) , 置于 10000 rpm 离心 5m in; 以下步骤同溶菌酶法 。 11413超声破碎提取法 [6 ] 收集对数生长期的菌液 5m l, 置于 10 000 rpm 离心 5m in; 弃上清 , 用 3m l 裂解缓冲液 (110mol/L NaCl, 50mmol/L EDTA , 50mmol/L Tris·Cl) , 加 30μl 10mg /m l溶菌酶冰水浴 30m in后超声处理 , 超声条件 : 250W 每次工作 5 s, 间隙 5 s, 重复 20次 , 再加等体积的酚 、氯仿 、异 戊醇 (25∶24∶1) , 置于 10 000 rpm 离心 5m in; 以下步骤同溶菌酶法 。 2 实验结果 211 分光光度测定
摘 要 : 高质量的微生物基因组 DNA是基因工程的前提 。目前国内外关于微生物基因组 DNA 提取的方 法很多 , 根据研究对象和目的不同而方法各异 。该文就现有方法中应用最为广泛的三种提取微生物基因组 DNA的方法进行了比较 , 并对它们进行一些改进 , 获得了针对不同细胞壁成分的微生物相应的简便 、快速 且高质量基因组 DNA 提取方法 , 并对提取的 DNA进行 PCR特异性扩增检测 , 获得较清晰的谱带 [1 ] , 为基因 克隆表达研究奠定了基础 。
收稿日期 : 2006 - 09 - 041 作者简介 :刘晓侠 (1978 - ) ,女 ,江苏丰县人 ,嘉兴学院生物与化学工程学院教师 ,博士 ,研究方向为基因工程 、发酵工程 。
刘晓侠 ,林建平 ,岑沛霖 :微生物基因组 DNA提取方法的比较与改进
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DNA 聚合酶缓冲液 , 015μl (215 unit) PfuTaq DNA 聚合酶 , 015μl 10 mmol/ l dNTP混合液 , 其余为双 蒸水 。
(11School of B iology and Chem ical Engineering, J iaxing university, J iaxing, Zhejiang 3140001; 21 Institute of B ioengineering, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310027)
213 PCR 特异性扩增的验证 将三种方法提取的放射形土壤杆菌基因组 DNA 为模板进行特异性扩增 , 见图 2。
3 讨论 通过对多种微生物基因组的提取来看 , 溶菌酶法较适合革兰氏阳性菌 , 而不适合提取革兰阴性
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嘉兴学院学报 第 19卷第 3期
改良的 CTAB[8 ]法适合于大多数微生物基因组的提取 , 且提取的 DNA 较其他两种方法纯 , 但由 于有些微生物的经 CTAB /NaCl处理后 , 经高速离心很难吸出上清液 , 在这种情况下 , 需采用改进的 超声破碎法 。
超声破碎法由于具有强烈的机械作用 、空化作用和乳化作用 , 对微生物细胞的细胞壁破碎较为完 全 , 且经酚 : 氯仿 : 异戊醇提取 , 可以较为完全的将 DNA 和蛋白质及其他杂质分开 , 但由于作用条 件剧烈 , 会造成 DNA 部分降解 , 使 DNA 回收率降低 。 参考文献 :
Abstract: H igh quality genom ic DNA from m icroorganism is the p recondition of genetic manipulation. Now many methods for the extraction of genom ic DNA are developed according to different research object and intention. Three kinds of methods w idely app lied are compared and reformed in isolation of genom ic DNA from m icroorganism. And ef2 fective methods for extracting high pure genom ic DNA are established considering different cell wall components. Ge2 nom ic DNA gained by three different methods above is specifically amp lified and clear band is observed by agarose gel electrophoresis, which is convenient to genetic manipulation later.