一、动物细胞的形态
• 贴壁细胞
这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞
依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面 上生长和繁殖。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形 态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。
• 悬浮细胞
这类细胞生长不依赖支持物表面，可在培养液中成悬 浮生长，通常呈圆形，如血液内的淋巴细胞。
a. 磷酸钙沉淀法：将溶解的 DNA 加在 Na2HPO4中， 逐渐加入CaCl2溶液，当 Na2HPO4和CaCl2形成沉 淀，DNA包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉淀 物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用
将DNA导入胞内。
优点：方法简单，可进行共转化
b. 电穿孔法：借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场，
⑤ 有良好的适于生存的外界环境
⑥ 及时分种，保持合适的细胞密度
一、动物细胞的培养条件
1. 器材的清洗和消毒
2. 水质
3. pH
4. 渗透压
5. 温度 6. 空气
1、器材的清洗和消毒
（1）器材的清洗： a. 浸泡（3%磷酸三钠） b. 刷洗 c. 泡酸（重铬酸钾、硫酸、水） d. 冲洗（自来水、蒸馏水、去离子水） （2）器材的消毒灭菌：
2、二倍体细胞系
原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种
细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定 特征的细胞株 • 由于该类细胞寿命有限，一般从动物的胚胎组 织中获取。如WI-38、MRC-5、2BS等
3、转化细胞系 失去了正常细胞的特点，获得了无限增殖的 能力。 • 转化细胞系具有无限生命力，常常倍增时间较短，
显性作用基因，如neo基因 。
（4）有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。
2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法 融合法
细胞融合法
化学法
物理法
显微注射法 基因枪法
病毒法
重组逆转录病毒介导法
重组DNA病毒介导法 多瘤病毒样颗粒介导法
DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 原生质融合法 微细胞介导法 鬼影红细胞介导法 染色体介导法
对培养条件和生长因子等要求较低，更适于大规
模工业化生产。如Namalwa、 CHO、 BHK-21、
Vero细胞等。
4、融合细胞系
•
细胞融合：指两个或两个以上的细胞合并成一
个细胞的过程
•
目前常用的融合方法有：仙台病毒融合法、聚
乙二醇融合法、电融合法
（1）仙台病毒融合法（很少使用）
融合过程：
a. 病毒加入两种细胞（4℃），附膜，细胞凝聚
生产-干扰素。
五、细胞库的建立
用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：
1、 原始细胞库（master cell bank， MCB）
2、 生产用细胞库（manugacture’s working cell
bank，MWCB），或称工作细胞库（working
cell bank， WCB）。
原始细胞库是单一来源的均质的细胞，对于二倍体 细胞，应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。贮存 时须有该细胞的详细档案，包括： （1）该细胞系的历史：来源、年龄和性别、细胞分离
如HEPES、 Na2HPO4/ NaH2PO4缓冲系统、
NaHCO3/CO2缓冲系统等
4、渗透压
• 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透 压有一定耐受性。 • 最理想的渗透压为290~300mOsm/kg • 为调整培养液的渗透压，一般采用加减NaCl的方法：
1mg/ml NaCl---32mOsm/kg
b. 对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。
c. 利用扩增系统，不断增加其基因拷贝数，获得高
效表达而稳定的工程细胞株。
四、常用生产用细胞的特性
（1）WI-38 1961年，来源于女性高加索人正常胚肺组织的 二倍体细胞系。 该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME（Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制在7.2。细胞的倍增时间为24 h，有限寿命为50代， 上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。
• 兼性贴壁细胞
这类细胞并不严格地依赖支持物，如CHO细胞。
二、动物细胞的化学组成和代谢
• 动物细胞的化学组成 无机成分：水、无机盐 有机成分：蛋白质、糖类、脂类、核酸 • 动物细胞的代谢 糖、脂肪和蛋白质的代谢分为三个降解阶段 （1）大分子降解为小分子
（2）小分子代谢产生三个主要的中间产物
（3）中间产物进入三羧酸循环
• 细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞 生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精 心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变， 从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加
或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条
件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产 品。
第二节 动物细胞的形态和生理特性
第一节 概述
第二节 动物细胞的形态和生理特性
第三节 生产用动物细胞的要求和获得 第四节 动物细胞的培养条件和培养基 第五节 动物细胞培养的基本方法 第六节 动物细胞大量培养的方法和操作方式
第七节 动物细胞生物反应器
第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求
第九节 动物细胞制药的前景与展望
第一节 概 述
（3）Vero 1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。 是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高倍体率为
1.7%，可持续地进行培养。通常用的培养基为199培
养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的 增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于
人体。
（4）Namalwa 1972年来源于肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病人 体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞。 该细胞有2.8%的高倍体率，多数细胞有12~14条标 记染色体，单条X染色体，无Y染色体。通常用的培 养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于大规模
Robert Hooke 及其制作的显微镜
Leeuwenhoek首次观察到了活的细胞
• 德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann创 立了细胞学说。 • 1885年Roux用生理盐水成功培养鸡胚组织。 • 1907年Harrison成功培养了离体的蛙胚神经组织， 并观察到神经细胞突起的生长过程。开创现代 细胞培养的新纪元。
三、动物细胞的生理特点
1、细胞的分裂周期长：一般12~48 h 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 接触抑制现象：指细胞在生长过程中达到相互接触时停 止分裂的现象。
3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的：时间长短决定
于细胞来源的种族和年龄 原代培养 有限细胞系 无限细胞系（连续细胞系）
4、动物细胞对周围环境十分敏感 对理化因素敏感：如渗透压、pH、离子强度、剪切
一、生产用动物细胞的要求 二、生产用动物细胞的获得 三、基因工程细胞的构建和筛选 四、常用生产用动物细胞的特性
五、细胞库的建立
一、生产用动物细胞的要求
1、只有从正常组织中分离的原代细胞才能用来生产生 物制品，如鸡胚细胞、兔肾细胞等 2、二倍体细胞，即使经过多次传代也可用于生产，如 WI-38，2BS细胞等
使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源DNA沿小孔
进入细胞。 特点：转化效率较高，但进入的DNA拷贝数较低
如何筛选工程细胞？
a. 依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统： 如用HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶） 选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞；用G418 （Geneticin）选择系统，筛选neor的转化细胞。
力、微量元素等。
5、动物细胞对培养基的要求高 必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、 细胞生长因子、贴壁因子等。 6、动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同
• 动物细胞生产药物
缺点：培养条件高、成本贵、产量低
优点：分泌胞外、收集纯化方便，较完善的翻译后
修饰，与天然产品一致
第三节 生产用动物细胞的要求和获得
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
动物细胞培养技术的发展
动物细胞培养
培养成功必备条件
① 所有与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持
绝对无菌，避免细胞外微生物的污染
② 必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质， 避免即使是极微量的有害离子的掺入 ③ 保证有适量的氧气供应 ④ 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物
1、真核细胞基因表达载体的构建
病毒载体：如牛痘病毒、腺病毒、反转录病毒、
杆状病毒等
质粒载体：穿梭质粒载体
用杆状病毒做载体的优点
① 该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组； ② 插入7~8kb的DNA不影响正常病毒粒子的形成； ③ 多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源 基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒 子； ④ 多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占 全部蛋白质的20~30%；
的方法、所用的培养材料等；
（2）该细胞系的特性：形态、生长的特性、种源的特 性等； （3）对各种有害因子检查的结果。
• 生产用细胞库：从原始细胞库来，或从单一安瓿来， 或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培 养扩增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库。 • 生产用细胞库也必须建立档案，而且需要进行无菌 性和无细胞交叉污染的检查，生产时需确定其最高 使用的传代数。
⑤ 用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选 阳性克隆；
⑥ 如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。
构建质粒载体一般含有如下基本成分： （1）允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。
（2）含有能使基因转录表达的调控元件。