广泛用于制备疫苗。
• （2）MRC-5：特性和用途与WI-38相似，
1966年来源于14周正常男性，对多种人的病 毒敏感，用于疫苗的生产。
• （3）CHO-K1：1957年从中国地鼠卵巢中分
离的一株上皮样细胞。在培养时需加入脯氨
酸。核型为2n=20~22。目前广泛用于构建工 程细胞的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养 缺陷突变株CHO-dhfr-，它常用的培养基为 DMEM培养基，加0.1 mol/L次黄嘌呤和
产品中DNA残留量。
• 1、原代细胞：是直接取自动物组织、器官，
经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。一般1g
组织约有109个细胞。 鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、淋巴细胞 费钱费劳力
• 2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、
克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并 纯化出某种具有一定特征的细胞株。
• 随机的，无法人为控制，同时融合率较低。
（2）PEG诱导融合
• 当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时，就会产生细胞聚 集作用。在除去PEG的过程中，即产生细胞融合现象。 • 所用的PEG分子量在1000-6000之间，一般浓度为40-50%，在 37℃下作用2-3分钟，其促融效果最佳。 • PEG促融合的作用机理不清，其促融作用也具有随机性，无法 人为控制。
细胞的分化（或特化）
形态分化在离体培养同样也存在。 离体培养的细胞分为两类： 贴壁依赖型（anchorage-dependent）和 非贴壁依赖型（anchorage-independent），前 者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。
动物细胞 结构图
• 1、贴壁细胞
特点：支持物 两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。前 旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内
动物细胞工程制药
张忠山
生命科学学院
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一、概述 二、动物细胞的形态和生理特点 三、生产用动物细胞的要求和获得 四、动物细胞的培养条件和培养基 五、动物细胞培养的方法和操作方式 六、动物细胞生物反应器及其检测控制系统 七、动物细胞制药的前景和展望
第一节 概述
• （1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英
S 期：DNA的合成，一般为6~8小时
• G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋
化，持续时间短，一般为2~5h。 • M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于 有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的 变化、分裂，并形成子细胞。
• 细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。
• 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现 象 • 大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需 要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附， 伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、 钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。
10%胎牛血清。目前已经被广泛用于高效表达外
来蛋白制品。
四、基因工程细胞的构建和筛选
• 原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者在生
产中都有使用，但在生产中采用更多的、更有前 景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种
工程细胞。当前被用以构建工程细胞的动物细胞
有CHO-dhfr-、BHK-21、Namalwa、Vero、 SP2/0和Sf-9等细胞。 • 那么如何获得动物工程细胞呢？
合的方法，从有抗羊红细胞活性的BALB/c小鼠 的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合的杂交 瘤SP2/HL-Ag亚克隆中分离得到。它不分泌任 何免疫球蛋白抗体链，能耐受8-氮鸟嘌呤（8-
azaguanine）20g/ml，但在含HAT选择培养基
中不能存活。通常用的培养基为DMEM培养基， 添加10%胎牛血清。
促融因素
（1）病毒诱导融合 （2）PEG诱导融合 （3）电场诱导融合 （4）其它诱导融合
（1）病毒诱导融合
• 仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱 疹病毒等 • 当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病 毒时，病毒或其组分会在细胞间起粘连作用 而使细胞聚集成团，细胞膜上的蛋白质和脂 质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。
• （8）Sf-9：1983年从亲代IPLB-SF21 AE中克隆 形成。亲代细胞则在1977年从秋粘虫
（Spodoptera frugiperda)的蛹卵组织中分离获得。
它对苜宿尺蠖核型多角体病毒（Autographa
california MNPV）和其他杆状病毒（Baculovirus）
高度敏感。通常用的培养基为Grace培养基，添 加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，以及
三、常用生产用动物细胞的特性
• （1）WI-38：1961年来源于女性高加索人正常
胚肺组织的二倍体细胞系，核型2n=46。该细 胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME （Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制在7.2，同工酶为G6PD B型。细胞的倍增时
间为24h，有限寿命为50代，上世纪60年代被
第三节 生产用动物细胞的要 求和获得
• 一、生产用动物细胞的要求
• 二、生产动物细胞的获得
• 三、常用生产用动物细胞的特性 • 四、基因工程细胞的构建和筛选 • 五、细胞库的筛选
传代细胞的要求
• 正常原代细胞 二倍体细胞 无限制
• 癌细胞生产药物需谨慎！
一、生产用动物细胞的要求
• （1）原代正常组织分离的细胞 • （2）二倍体细胞，即使是传代细胞 • （3）传代细胞用于生产 • （4）按照FDA对细胞株的要求，控制最终
1、真核细胞基因表达 载体的构建
• 目前一般使用的载体有两类：一是病毒载体， 如牛痘病毒、腺病毒和逆转录病毒和杆状病
毒等。牛痘病毒已被广泛地用来构建成多价
疫苗，腺病毒和逆转录病毒载体正被试用用 于基因治疗中，而杆状病毒载体-昆虫细胞 系统已被成功地用于300多种外源基因的高 效表达。
• 用杆状病毒做载体有许多优点：
（3）电场诱导融合
• 将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电 场作用时，细胞之间就会发生紧密接触，形成稳定的串珠状 偶极子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就 会发生膜击穿，不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融 合，形成一个双核或者多核的细胞。 • 一般来说，击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50微 秒。 • 电场诱导融合不损伤细胞，具有可人为操作的控制的特性， 融合率较高。
• （4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。
应用领域
• 生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞
所不能生产的药用蛋白。 • 基础研究的细胞材料：细胞模型 • 种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子 细胞。
第二节 动物细胞的 形态和特点
• 一、动物细胞的形态
• 二、动物细胞的生理特点
一、动物细胞的形态
4、动物细胞对周围环境比较敏感 无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易 产生影响。 5、动物细胞培养基的要求高 8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为
与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、 主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因
子，而且不同种类要求又有变化。
• 6、动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不 同 • 场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体， 前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上
Burkitt淋巴瘤的病人体中，后在瑞典构建的一
株人的类淋巴母细胞，高细胞有2.8%的高倍 体率，多数细胞有12~14条标记染色体，单条
X染色体，无Y染色体。通常用的培养基为
RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于大规模 生产-干扰素。
• （7）SP2/0-Ag14：该细胞是1978年中通过融
国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切
成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。 • （2）组织培养或细胞培养。1885年德国生 理盐水培养鸡胚组织，至1907年，细胞体外 培养宣布进入一个新时代。
• （3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养 以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、
导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和 技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色 体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术， 细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理 论和技术。
（1）该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组。
（2）插入7~8kb的DNA不影响正常病毒粒子的
形成。
（3）多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系， 因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形 成有感染力的病毒粒子。
（4）多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生 的蛋白质可占全部蛋白质的20~30%。 （5）用光学显微镜可看到多角体，容易以此为 标记物来挑选阳性克隆。 （6）如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表 达外源基因。
者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、
胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞
片。
• 2、悬浮细胞
这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养
液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生
产干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。
• 3、兼性贴壁细胞
兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴
• （5）Vero：1962年来源于正常的成年非洲绿
猴肾。是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高
倍体率为1.7%，可持续地进行培养。通常用的 培养基为199培养基，添加5%胎牛血清。该细
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胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、
狂犬病病毒，已被批准用于人体。
• （6）Namalwa：1972年来源于肯尼亚患有
0.01m mol/L胸苷，以及10%小牛血清。
• （4）BHK-21：1961年从5只无性别的生长1天 的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现在广泛采用的