Evaluation of liquid from the Papanicolaou test and other liquid biopsies for the detection of endometrial and ovarian
cancers
SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE
妇科癌症筛查研究背景
●妇科三大癌症：子宫颈癌，子宫内膜癌，卵巢癌
●巴氏涂片（Pap test）可用于早期子宫颈癌筛查，显著降低致死率；但是子宫内膜癌和卵巢癌目前缺乏可靠的早期筛查方法
●目前子宫内膜癌的主要检测方法：阴道超声无法分清良性恶性；假阳性率高，50个检出阳性中只有一个是真阳性
●目前卵巢癌主要检测方法：蛋白标志物CA-125和阴道超声占卵巢癌90%的高级别恶性肿瘤很多由输卵管癌转移而来，不易发现；发现即为晚期，5年生存率低于30%
●迫切需要建立可靠的子宫内膜癌和卵巢癌早期筛查方法
本文提出：“PapSEEK”---妇科癌症早筛新方法
两种brush取样方法+外周血+两个参数分析
PapSEEK 方法流程
样本情况
体细胞突变检出方法
●3轮PCR、139对引物，扩增片段110-142 bp
●覆盖18个基因：AKT1, APC, BRAF, CDKN2A, CTNNB1, EGFR, FBXW7,
FGFR2, KRAS, MAPK1, NRAS, PIK3CA, PIK3R1, POLE, PPP2R1A, PTEN, RNF43, and TP53.
●覆盖9392个位点
●UID设计：14个随机排列的碱基
●某个突变有包含同一个UID的大于90%的reads支持即为真
●过滤标准：
一. 突变需满足以下两条标准之一：
1.在COSMIC中有记录
2.预测为抑癌基因的失活突变（无义突变，读码框外的插入或缺失突变，经典的剪切位点突变）
二. 排除掉同义突变（终止子突变除外）和内含子突变（剪切位点突变除外）。
三. 若检出的突变不能与hg39有唯一比对（read能比对上多个位置）则排除。
方法参考文献：I. Kinde, J. Wu, N. Papadopoulos, K. W. Kinzler, B. Vogelstein, Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 9530–9535 (2011).
非整倍体变异的检出方法
●对每个样本用一对引物，扩增基因组上~38.000 loci of LINES。
其中一个引物上包含UID序列。
●用Within-Sample AneupLoidy DetectiOn (WALDO)软件分析单个染色体臂增加或缺失，以及39个染色体臂上的等位基因不平衡特征。
●WALDO整合了一个支持向量机（SVM）来区分非整倍体和整倍体的样本。
●SVM是由3150个合成的低肿瘤含量的非整倍体样本和677个整倍体外周血白细胞样本训练而来。
●若SVM区分的分数超过给定值或检出7号和8号染色体臂的增加，则此样本定义为检出阳性。
因为7号和8号染色体的臂增加是子宫内膜癌和卵巢癌的常见分子指征。
方法参考文献：I. Kinde, N. Papadopoulos, K. W. Kinzler, B. V ogelstein, F AST-SeqS: A simple and efficient method for the detection of aneuploidy by massively parallel sequencing. PLOS ONE 7,
e41162 (2012).
实验结果
1. Pap brush 样本的体细胞突变和非整倍体检出情况
PapSEEK法（Combined assay）：
●提高子宫内膜癌检出率至81%（78%早期& 92%晚期）
●常见突变基因：PTEN (64%), TP53 (41%), PIK3CA (31%), PIK3R1 (29%), CTNNB1 (21%), KRAS (18%), FGFR2(11%), POLE (9%), APC (9%), FBXW7 (8%), RNF43 (7%), and PPP2R1A.
●提高卵巢癌检出率至33%（34%早期& 33%晚期）
●常见突变基因：TP53 (74%)
2. Tao brush 样本的体细胞突变和非整倍体检出情况
PapSEEK法（Combined assay）：
检出常见基因突变：PTEN (63%), TP53 (42%), PIK3CA (36%), PIK3R1 (20%), KRAS (17%), CTNNB1 (15%), FGFR2 (15%), RNF43 (11%), PPP2R1A (7%), POLE (7%), and FBXW7 (6%)
PapSEEK 法：体细胞突变和非整倍体两指标相结合可以提高阳性检出率!
3. 两种取样方法在两种癌症中得到的检出率比较
●Tao brush样本阳性检出率均高于Pap brush样本，更优越！
●子宫内膜癌早期检出率低于晚期，卵巢癌早期晚期检出率相当
可能的原因：
有些卵巢癌发生于输卵管，输卵管的癌细胞可进入宫腔被PapSEEK检测到；卵巢癌晚期，输卵管通常已被破坏，病灶的癌细胞不易进入宫腔。
针对这种情况，测血浆DNA会更有益。
●采自同一病人的Pap brush样本&Tao brush样本PapSEEK阳性检出率比较：
103例子宫内膜癌：82% & 91%，42例卵巢癌：17% & 45%，说明Tao brush取样法更好！
4. 由于卵巢癌brush样本检出结果不理想，检测血浆cfDNA验证
①83例有Pap brush样本的患者取外周血
②引物覆盖16个靶基因的1933个不同区域
③比较Pap样本和血浆检出结果
●血浆检出率43% （早期35% & 晚期56%），对比Pap样本阳性率40%，两者阳性检出有部分重合
●血浆早期MAF 0.85%，低于Pap样本5.7%
●血浆阳性的患者组织阳性的比率为88%
小结-- PapSEEK法检测两癌的结果
●大多数子宫内膜癌能被检测到：
93% Tao brush样本& 81% Pap brush样本
●小部分卵巢癌能被检测到：
45% Tao brush样本& 33% Pap brush样本
●健康人基本检测不到：
0% Tao brush样本& 1.4% Pap brush样本
●卵巢癌：
Pap brush样本+血浆检测能提高检出率到63%
Tao brush样本+血浆也许能表现更好?
研究中的不足和需要改进的地方
1.PapSEEK研究为验证性实验，即都是已确诊的患者
●需设定无偏好性的患者组验证PapSEEK方法
●需入组良性和恶性患者作比较
2. 在卵巢癌样本中，有些在Pap或Tao brush中有突变检出的患者在对照组织中无检出。
可能的原因：
●肿瘤异质性造成的检出差异
●有些卵巢癌患者同时有子宫内膜癌或者恶性子宫内膜病变，医生不易发现
●非恶性细胞的克隆型增殖。
如子宫内膜异位就是这类细胞增殖导致的。
而有报道在子宫内膜癌中发现的基因突变可以导致子宫内膜细胞增殖。
克隆性增殖引起的突变可能造成假阳性，但如果能证实卵巢癌患者通常会发生大量细胞克隆型增殖的现象，也可能使卵巢癌检测的灵敏性增加。
故有待进一步研究
文章作者下一步的计划
●大规模的PapSEEK筛查临床试验
●入组妇科癌症高危人群，如有遗传因素、肥胖、有早期症状如绝经后不规律阴道出血的待查妇女
试验中需要考虑的问题：
●PapSEEK花费比传统的巴氏实验稍高，和肠镜、乳房X射线检查费用相当
●取样方法选择（Pap or Tao）：需综合考虑灵敏度和舒适度
●是否该结合血浆的结果？可能会提高灵敏度也可能引入假阳性
●是否该结合蛋白标志物结果？
●多次检测能否提高灵敏度？多次采样的间隔时间选择？
●如果PapSEEK检测阳性，下一步该如何处理？继续超声检查？
●如果PapSEEK检测阴性，多久复查一次？
总之，PapSEEK法为子宫内膜癌和卵巢癌的筛查提供了另一个可能可行的思路。