定向进化不是定点突变
• 定向进化：突变 筛选
突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
• 定点突变：
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
7.分子内交联修饰
• 采用含有双功能基团的化合物，如二氨基丁烷、 戊二醛、己二胺等，与酶蛋白分子中两个侧链基 团反应，形成共价交联，可以使酶分子的空间构 象更为稳定，从而提高酶的稳定性的修饰方法称 为分子内交联修饰。
三、小分子修饰剂的作用
1. 用于酶分子结构和功能的研究 2. 用于改进酶性质
第三节 有机大分子对酶的修饰
2．提高酶分子的稳定性
• T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.81.4℃. • 8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了 0.7-4.2℃
3．提高底物的专一性和增加对新底物的催化活力
• Beuve和Danchin展示腺苷酸环化酶突变后，鸟苷 酸环化酶活力提高了4.5倍，但腺苷酸环化酶活力 仅残留4% • Zhang等利用定向进化把β-半乳糖苷酶改进成以果 糖为底物的酶
三 氨基酸置换修饰
• 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨 基酸，引起酶蛋白空间构象的某些改变， 从而改变酶的性质和功能。 提高酶活力或增加酶稳定性。
例：对β-干扰素修饰，将17位半胱氨酸 → 组氨酸，提 高稳定性 mRNA UGU,UGC → AUG,AGC DNA ACA,ACG → TCA,TCG 将A突变成T，定点突变
（四）羰二亚胺法
• 修饰酶分子上的羧基。
3.2 糖类的修饰反应
（一）右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修饰反应 1.溴化氰法 右旋糖苷经溴化氰活化后，在碱性条件下与酶 的游离氨基共价连接，生成修饰酶。
2.高碘酸氧化法
高碘酸将右旋糖苷上邻双羟基氧化成醛基，醛基再与酶 分子上的氨基结合而生成修饰酶。
（二）糖肽的修饰反应
七、酶修饰方法
1．酶分子侧链基团的化学修饰 2．有机大分子对酶的化学修饰 3．蛋白质类及其他
第二节 酶分子侧链基团的化学修饰
一、几种重要的修饰反应
1.酰化及其相关反应 修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟 乙酸乙酯、O-甲基异脲等。 修饰残基：氨基、羟基、酚基、巯基等。
2．烷基化反应
（三）聚氨基酸修饰酶
聚赖氨酸修饰酶 Lys上的氨基与含羧基较多的酶的羧基通过羰二亚胺产生交联。
3.4 天然大分子对酶的修饰作用
• 肝素修饰酶 肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成。
• 羰二亚胺法
• 用羰二亚胺活化肝素分子上的羧基后，与酶上的氨 基共价连接。
• 人血清白蛋白修饰酶
• 戊二醛法
• 利用戊二醛双功能使白蛋白上的和酶分子上的氨基 相互交联。
• 医药
解除医用酶免疫源性和抗原性
提高医用酶稳定性
延长医用酶体内半衰期
• 生物技术领域
改变酶最适pH 改变酶底物专一性 有机溶剂可溶解酶 提高酶耐热、酸、碱、有机溶剂能力
二、酶修饰的方向
1．核酸水平：利用基因操作技术对DNA 或 mRNA 进行改造或修饰 2．蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的 一级结构进行改造
三、酶化学修饰的基本原理
3．维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 • 大分子修饰剂产生的空间障碍可阻挡蛋白水解酶接近酶分 子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 • 酶分子上许多敏感基团参与修饰反应，也减少了酶分子遭 受蛋白水解酶攻击破坏的可能性。 4. 消除酶的抗原性 • 有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键，破坏了 酶分子上抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低乃至消除。 • 能“遮盖“抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应。
• 将PEG的末端羟基转化为叠氮基，然后与酶反应。 ⑴PEG甲氧甲酰甲酯制备
⑵PEG酰肼制备
⑶PEG羧甲基叠氮化物制备
⑷活化PEG与酶交联
•
（二）琥珀酸酐法
• 用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条件下将PEG活化， 经减压浓缩得活化PEG，可与酶分子上氨基交联。
（三）三氯均嗪法
• PEG经三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或减压蒸 馏，制得活化PEG。
• 修饰剂：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、 苯甲酰卤代物等。 • 修饰残基：氨基、巯基、羧基、甲硫基、咪唑基等。
3．氧化和还原反应
• 修饰剂：氧化试剂（H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等）；还原 剂（2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等） • 修饰残基：巯基、甲硫基、吲哚基、酚基等（氧化）；二 硫键（还原）。
三、举例
3.1 聚乙二醇及其修饰反应
• 聚乙二醇的特点：
①线性分子HO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH； ②具有良好的生物相容性和水溶性； ③在体内无毒性、无残留、无免疫原性； ④末端活化后可与酶产生交联； ⑤覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学 发生改变。
（一）叠氮法
2．氨基的化学修饰
• L基修饰试剂：乙酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸 （TNBS）、碘代乙酸、还原烷基、。 • ２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）可用于测定酶蛋白中 Lys数量。 • 常用２，４-二硝基氟苯(DNFB，Sanger试剂)、丹磺酰氯 (DNS)修饰多肽链N末端，用于N末端的测定。
四、对修饰剂的了解
1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度、对蛋 白质的吸附性 2．修饰剂上反应基团的数目及位置 3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件
五、酶性质的了解
1．酶活性部位情况 2．酶的稳定条件、酶反应最适条件 3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性 等
六、反应条件的选择
1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例 2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH 条件 3．反应温度及时间
糖肽分子上有游离氨基，活化后能与酶分子上氨基反应。 ① 2,3-异氰酸甲苯活化法
②戊二醛法
3.3 合成大分子多聚物修饰酶
（一）聚N-乙烯吡咯烷酮 N-乙烯吡咯烷酮修饰酶时，首先要开环水解，经活化反应，才 能与酶联结。
（二）聚乙烯醇修饰酶
聚乙烯醇与硝基苯酰氯反应后，其产物的硝基用连二亚 硫酸钠还原成氨基，与酶分子中羧基共价连接。
三．定向进化的选择策略
– 突变 – 蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X光片 消化分析
定向进化的基本方法
• 高突变菌株
Stratagene 公司构建了缺失DNA修复3个途径的大肠 杆菌菌株，基因突变率高5000倍
• 易错PCR
DNA shuffling
体 外 定 向 进 化
Increasing the ee-value of the lipasecatalyed hydrolysis of the chiral ester
– 化学进化 – 生物进化
二．概念
随机突变+定向选择＝目标突变体
最适生长温度提高了！
诱发突变的 因素
细菌
50 C培养
0
最适生长温度为 37 C
0
突变体库
选择压力 （温度）
温度耐受型突 变体
定向进化
– 属于蛋白质的非合理设计，不需事先了解酶的 空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化 条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重 组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向 选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
3. 羧基的化学修饰
• 主要涉及谷氨酸和天冬氨酸。 • 产物一般为含酯类或酰胺类的修饰酶。
• 水溶性的碳二亚胺为最常用的修饰剂，可定量测 定羧基含量。 • ．咪唑基的化学修饰：焦碳酸二乙酯。 • ．胍基的化学修饰：丁二酮和1，2-环己二酮为修 饰剂。 • ．二硫基的化学修饰：通常通过还原的方法进行 修饰。
一、概念
• 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发 生某些精细的改变，从而改变酶的特性
二、常使用的水溶性大分子修饰剂
• 糖及糖的衍生物（右旋糖酐、糖肽、Sephadex G25） • 聚乙二醇、大分子多聚物（如乙烯酮、乙烯乙酸、 丙烯酸等的单聚或共聚物） • 具有生物活性的大分子物质（如肝素）、蛋白质 等。 • 修饰的方法如：溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二 醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等
第五章
酶的分子修饰和改造
第一节 酶化学修饰的原理和方法
一、酶的化学修饰原因
1．稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。 2．作用的最适条件不符。 3．酶的主要动力学性质的不适应。 4．临床应用的特殊要求。
酶化学修饰的应用
• 理论研究
酶中特定基团之间的距离 氨基酸残基的存在状态 氨基酸测序 确定酶活性部位 氨基酸数量测定
75%
81%
%ee
57% 31% 2%
0% 0 1 2 3 4 mutant generations
四
定向进化的应用
1．提高酶分子的催化活力
• L—天冬氨酸酶定向进化研究 – 进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。 – 得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热 稳定性均优于天然酶
第四节 其它修饰方法及修饰酶的性质
一、金属离子置换修饰
1．概念：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶 的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换 修饰。 2．常用离子 常用二价金属离子。 3．修饰方法
二、肽链有限水解修饰
• 用专一性较强的蛋白酶或肽链为修饰剂，使肽链 部分水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变， 从而改变酶的性质和功能。 • 增加某些酶的活性 • 减少或消除某些酶的抗原性。
• 氨基酸的置换 • 肽链有限切除 • 氨基酸残基的修饰等