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第五章酶分子修饰
•几种重要的修饰反应类型： •烷基化反应 •酰化反应 •氧化还原反应 •芳香环取代反应
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第五章酶分子修饰
1. 化学修饰反应的类型
1) 烷基化反应
试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团
（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：
氨 基 （ Lys ， Arg ） ， 巯 基 （ Cys ） ， 羧 基 （ Asp 、 Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。
•连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
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第五章酶分子修饰
• 4) 芳香环取代反应
• 试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
• 碘代：
• I2＋
+ HI
• 硝化：
• (NO2)4C + +•(（N四O2硝)3基CH甲烷）
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第五章酶分子修饰
• 2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
•2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表 面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维 持酶活性部位微环境相对稳定。
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第五章酶分子修饰
• 第四节 酶化学修饰的设计
• 一、充分认识酶分子的特性 包括酶的——
• 1. 活性部位情况 • 2. 稳定条件及反应最佳条件 • 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性
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第五章酶分子修饰
•二、 修饰剂的选择 要考虑——
• 1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大 的分子量）
• 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有 较多的反应活性基团）
• 3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件
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第五章酶分子修饰
•三、反应条件的选择 要注意——
• 1. 酶与修饰剂的分子比例 • 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 • 3. 反应温度及时间
•（高度专一的对酚羟基修饰）
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第五章酶分子修饰
•8）吲哚基的化学修饰
• 来源：Trp • 修饰反应：氧化反应 • 修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺（NBS)
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第五章酶分子修饰
• 各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸 侧链基团
修饰剂
Lys Asp、Glu
氨基 羧基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙 酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸
酰基化反应
•
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第五章酶分子修饰
3) 氧化和还原反应
试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 还原剂：巯基乙醇、DTT（二硫苏糖醇）等。 可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基
（Trp）、咪唑基，酚基等。 可被还原的侧链基团：二硫键。
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第五章酶分子修饰
• 若某基团被修饰后：
• 酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团
• 酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团
• 但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结
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第五章酶分子修饰
•活性中心基团的鉴定标准
•①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 •②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。
结构。
• 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂
• 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间
障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶
的活性部位。
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第五章酶分子修饰
• 三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解 酶
• 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
• 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接 近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
• 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少 了受蛋白水解酶破坏的可能性。
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第五章酶分子修饰
•四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
•1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成 了共价键。
• 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除
• “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
• （一）研究酶的结构与功能的关系。
• （二）人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应
•
用范围。
•
•
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第五章酶分子修饰
•1. 修饰酶的热稳定性
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• 2. 修饰酶的抗原性
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•3. 修饰酶对各类失活因子的抵抗力
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• 差别标记：
•化学修饰
•底物或抑制剂存在
活性基团不与修饰剂作用
•含同位素标记
•去除底物或抑制剂
原来被保护的基团带同位素标记
• 的同样试
剂
• 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。PP Nhomakorabea文档演模板
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•2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）
• 用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一 氨基酸残基的侧链基团。
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•3.蛋白质工程：（定点诱变法）
• 将酶相应的cDNA定点突变，突 变的cDNA只表达一个或几个氨基酸 被置换的酶蛋白，测定其活性可知被 置换的氨基酸是否为活力所必需。
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第五章酶分子修饰
• 第二节 酶化学修饰及修饰目的
• 一、酶化学修饰
1.限制酶大规模应用的原因：
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•Active site
•The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.
1)细胞外稳定性差；
2)酶活性不够高；
3)具有抗原性。 •
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2. 改变酶特性有两种主要的方法：
1)通过分子修饰的方法来改变已分离出 来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的 基因而达到改造酶的目的。
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• 二、酶化学修饰的目的
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第五章酶分子修饰
• 第五节 酶化学修饰的种类及应用
• 一、酶的表面化学修饰
• （一）大分子修饰（大分子结合修饰） • 是目前应用最广的酶分子修饰方法。 • 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶
的空间结构发生某些精细的改变，从而改变 酶的特性与功能的方法。
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第五章酶分子修饰
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2020/12/11
第五章酶分子修饰
•第一节 酶的活性中心（active site）
•
•一、活性中心的概念 由必需基团构成的与酶催化活性有关的 特定区域.
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第五章酶分子修饰
二、活性中心的共性
• (1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 • (2)活性部位是一个三维实体。 • (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 • (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契 • 合）。 • (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水 • 作用等次级键结合。
修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。
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第五章酶分子修饰
烷基化反应
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2) 酰基化反应
试剂特点：
含有
结构，作用于侧链基团上的亲核
基团，使之酰基化。
可作用基团：
氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟
基（Tyr）
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第五章酶分子修饰
•3)亲和标记（位点专一性修饰）
• 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计 合成的含有活泼反应基团的底物类似物。
•作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加 以修饰标记。
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第五章酶分子修饰
•化学修饰的专一 性
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第五章酶分子修饰
•亲和修饰剂：
• ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基 • 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 • 残基亲和力小。 • ②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性 • 中心的基团形成稳定的共价键。
水溶性碳化二亚胺
Arg
胍基 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮
Cys
巯基 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺
二硫键 巯基乙醇、DTT
His 咪唑基 焦碳酸二乙酯、碘乙酸
Tyr 酚羟基 碘、四硝基甲烷
Trp 吲哚基 N-溴代琥珀酰亚胺
• 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）
•
+CO2
•
+
•修饰酶 （240nm)