HIV模型图
脂双层膜 gp120 包膜糖蛋白 gp41 p24衣壳蛋白
p17内膜蛋白
p7核衣壳蛋白 逆转录酶 整合酶 蛋白酶
env基因的结构及env蛋白
env编码 外膜蛋白gp120 跨膜蛋白gp41 （包膜蛋白前体gp160为 gp41聚合体）

gag基因的结构及gag蛋白功能
gag基因编码病毒核心蛋白 前体蛋白p55（p39为p55的 碎片）、衣壳蛋白p24、内 膜蛋白p17
实验蓝图
实验原始记录
结果的判定
首先要确定可见到标本质控带.如果标本质 控带是阴性,则检测无效;因为这表示技术上有 错误,如未加样本,酶结合物或底物液。
与强和/或弱阳性对照试剂膜对照,确定检测 试剂膜上每一条带的分子量。 按照试剂盒说明书判定标准，判断待测样 品为阳性、阴性或不确定。
试剂盒说明书
7.2.1 试剂内对照 7.2.2 室内质控品对照 7.2.3 开展抗体相关检测的实验室须参加有 资质机构组织的能力验证，或室间比对。
出现以下问题，提示存在质量隐患，应引起重视：运输包装、内盒或试剂盒的物理损 伤；在单包装内存在混杂物质；标签出现错误、缺失或字迹模糊 （特别是产品名称 或出产厂家名称，批号和货号，失效期或/和生产日期）；缺失目录；泄漏或污染； 不适宜的存放条件；保护包装纸破损或污染；未达到质量控制标准 （阳性/阴性控制 结果以及质控条带出现与否等标志）；试剂质量问题须报告省确证中心实验室。
7.1.3 Levey-Jennings质控图
7.1.3.2 质控规则 实验室在报告结果之前必须评价质控数据，可通过图形记录的检查或由 计算机审核结果来决定。目前有许多质控规则，常用的是12S和13S规则。 （1）告警（12S）：当外部质控品的S/CO值超出 +2s范围时，系统处于告警 状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。若将12S做失控标 准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。 （2）失控（13S）：当外部质控品的S/CO值超出 +3s范围时，系统处于失控 状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部质 控品 稳定性下降所致。 7.1.3.3 质控图的分析及失控处理 实验室应建立质控图分析及失控情况处理的程序。当出现失控时，必须 找出发生问题的原因，找出解除问题的方法，并消除原因。
WB法HIV抗体确证实验质控
第二章 HIV抗体检测 7.1
试剂盒内提供的阳性和阴性对照：判 断每次实验的有效性，不能作为室内 质控品使用；每次须有，且只能同批 号试剂盒用；如无效，须重做。 非试剂盒组份的外部质控品：监控 酶免或发光法抗体检测的室内质量控制 检测的重复性，且须为弱阳性；判 断该批临床样品检测的可信性；每 次须有；失控须重做。可买或自制： 稳定、无菌、不含影响试剂反应的 防腐剂。
外部质控品？实验操作？不同人员？仪器？（如加样枪？洗板 机堵孔？酶标仪未每年校准？）绘制质控图错误？……
7.1.4
室内质控其他方式—“即刻法”质控
7.1.4
室内质控其他方式—“即刻法”质控
（1）当SI上限和SI下限 <n2s时表示处于控制范围 内，可以继续测定。继续 重复以上各项计算。 （2）当SI上限和SI下限 有一值处于n2s～n3s值之间 时说明该值在2s～3s范围 ，处于“告警”状态。 （3）当SI上限和SI下限 有一值> n3s值时说明该值 已在3s范围之外，属“失 控”。 “即刻法”只能在前 20次内使用，超出即可采 用L-J质控图方法。
WB法HIV抗体确证实验质控
一、室内质控: 仪器质控：仪器是否运转正常，管路是否堵塞； 过程质控： 1、试剂质控，强阳、弱阳、阴性对照； 2、样品质控，有无交叉污染，相邻的槽道是否 出现完全一样的条带； 3、数据质控，室温25±3℃（ ＜20 ℃ 需开空调 ），结果判读需两名判读人和一名审核人。 二、外部质控：参加有资质机构组织的能力验证，即室 间比对，如全国艾滋病检测实验室HIV抗体血清学能力验 证。
HIV基因组
条带
ENV区 gp160:gp41的聚合体 gp120:外膜蛋白 gp41:跨膜蛋白 POL区 p66:逆转录酶 p51:逆转录酶 p31:核酸内切酶 GAG区 p55:前体蛋白 p39:p55的碎片 p24:核心蛋白 p17:核心蛋白 宽的扩散糖蛋白带 扩散糖蛋白带 扩散糖蛋白带 细窄条带 细窄条带 双重条带 细窄条定
孕妇第一次确证
MSM第一次确证
再次确证阴性
孕妇4周后随访确证结果
MSM4周后随访确证结果
From不确定to阳性
送检时间：2011年1月
送检时间：2011年2月
质量控制
第二章 HIV抗体检测
7 7.1 7.2 质量控制 酶免或发光法抗体检测的室内质量控制 快速法抗体检测质控
常 州 市 疾 病 预 防 控 制 中 心 南华大学附属南华医院
Changzhou Center for Disease Control and Prevention
艾滋病抗体检测技术（免 疫印迹法）及质量控制
黎俊宏 检测检验中心 艾滋病确证实验室
全国艾滋病检测技术规范（2015年修订版） 第六章 艾滋病病毒感染实验室检测策略
条带位置
试剂批号不同甚至同一批号不同盒子，同一条带 的位置并不是相同的
早期感染带型？（疑似）
Gp160+p24 gp120很弱或者没有或还有其他
早期感染带型？（疑似）
早期感染带型？（疑似）
进展带型？
AIDS（晚）期带型？
ENV带强度保持恒定，p24缺失或强度明显降低
在HIV颗粒中，外膜蛋白（env）基因编码的 一个蛋白经糖基化后形成包膜蛋白前体（ gp160），其在蛋白酶作用下裂解成外膜蛋白 （gp120）和跨膜蛋白（gp41）；核心蛋白（ gag）基因编码的前体蛋白（p55）被蛋白酶裂 解为衣壳蛋白（p24）和内膜蛋白（p17）， p39为p55的碎片；逆转录酶蛋白（pol）基因 编码的逆转录酶（p66、p51）和核酸内切酶（ p31），而机体对上述HIV蛋白产生相应的抗体 ，又在WB中出现相应的不同组合的带型。 这既是确证HIV抗体阳性的条件，又能作为 HIV感染期和AIDS期的参考依据。
7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.1.4
试剂盒内部对照 室内质控品 Levey-Jennings质控图 室内质控其他方式—“即刻法”质控
7.1.3 Levey-Jennings质控图
7.1.3.1 质控图参数 外部质控品的均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对外部质控 品重复测定的基础上。一般采用在不同批次检测取得至少20个数据； 如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少 于4个质控血清测定结果，以建立一个临时性的均值和标准差，当达到 20批次数据后，替代临时性的均值和标准差。 （1）算术平均值（ ）：代表一组质控品测定S/CO值的均值。为了统计 学上有显著性意义，应该采用至少20次（天）测得的外部对照质控品 的S/CO值计算平均值。 （2）标准差（s）：是描述样品与均数之间离散程度的一个指标，是与 质控品S/CO值均值有关的预期范围。一组S/CO值的标准差以s表示。 （3）变异系数（cv）：是反映各次S/CO值相对于均值离散程度的一个 指标，可以用来衡量检测的重复性或精密度。 （4）控制限：由实验室根据对外部质控品检测结果的均值和标准差来 确定。例如，按照12S质控规则，控制限为外部质控品S/CO均值加减2 个标准差；按照13S质控规则，控制限为外部质控品S/CO均值加减3个 标准差。
WB检测HIV抗体的原理
全病毒裂解液电泳得到的膜条
硝酸纤维试剂膜条上结合了天然灭活的HIV-1型病 毒蛋白的分离颗粒和特异性的HIV-2型合成多肽。 在膜条分别加入稀释的血清或血浆样本或对照， 孵育。如果样本中含有HIV-1和HIV-2型的特异性 抗体，则抗体会与试剂膜条上的HIV-1蛋白和HIV2多肽结合，通过清洗去除试剂膜条上的未结合物 ，与HIV蛋白特异性结合的抗体再通过与带有碱 性磷酸酶的羊抗人IgG抗体结合，加入BCIP/NBT 底物等一系列反应即可显色。

pol基因的结构及pol蛋白
pol基因编码的酶类 p66和p51蛋白为逆转录酶 p32蛋白则为整合酶 P11蛋白为蛋白酶

确证试验的要点
严格遵守实验室标准操作程序(SOP) 严格按照试剂盒说明书操作 严格控制防止样品间的交叉污染
试剂
MP生物医学亚太私人有限公司（MP） HIV-1/2混合型试剂（MP HIV BLOT 2.2） 上海英旻泰生物技术有限公司（IMT） HIV-1/2混合型试剂（IMT HIV-1/2 Blot）
RIBA/LIA 条线/线性免疫试验 LIA 条带免疫试验 RIPA 放射免疫沉淀试验
IFA
免疫荧光试验
WB的原理
Western Blot与Southern或Northern杂交方法 类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶 电泳 ，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“ 显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质 样品，转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载 体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分 离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体 上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免 疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应 ，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的 特异性目的基因表达的蛋白成分。
HIV-1抗体阳性 检测出2条env带（gp160/gp41和gp120）及gag （p17，p24，p55）或pol（p31，p51，p66） HIV抗体阴性 没有病毒的特异性条带或只检测出p17抗体 HIV抗体不确定 出现任何病毒特异条带，但不足以判断为阳性
技术规范（2009版）
HIV-1抗体阳性 至少有2条env带（gp41和gp160/gp120）出现，或至少1 条env带和p24带同时出现。 HIV抗体阴性 无HIV抗体特异带出现。 HIV抗体不确定 出现HIV抗体特异带，但不足以判定阳性。 HIV-2抗体血清学阳性 出现HIV-2型特异性指示带的样品：如果同时呈HIV-1 抗体 阳性反应，只需报告HIV-1 抗体阳性，不推荐进一步做 HIV-2 抗体确证试验；如果同时呈HIV-1抗体不确定或阴性 反应，需用HIV-2型确证试剂再做HIV-2的抗体确证试验。 同时符合以下二条标准，即出现至少2条env 带（gp36和 gp140/ gp105），和试剂盒提供的阳性判定标准，可判为 HIV-2抗体阳性。