① 推算法 一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤 出来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ② 根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分 子物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物 质，然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大 分子物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为 止，根据上样量即可推算出配体的结合量。

第三节
亲和层析应用
一、纯化大分子物质
1） 抗原、抗体、抗原－抗体结合物（以 金黄色葡萄球菌蛋白为配体） 2）糖蛋白 以凝集素为配体 3）核酸 PolyU-Sepharose分离mRNA PolyA-Sepharose分离与mRNA特异结 合的蛋白质
二、研究酶的结构和功能
•
•
•
在进行酶的结构与功能研究时，经常使用专一的化学 试剂改变酶的功能团。 这种操作往往会引起酶活力的不完全丧失，但是难以 确定残留的酶活力是代表残留的天然酶活力 ? 还是化 学试剂作用后酶的催化能力变小了? 这就须将具有生物活性的和失去活性的蛋白质分开后， 进行活力检测才能确定。 它们之间的分离是比较困难的。 然而，亲和层析法是可以解决这一问题的。 原理：失去活性的蛋白质与配体无亲和力，有活性的 则与配体有亲和力。以此分离。
第五章
亲和层析


第一节
第二节 第三节
亲和层析基本原理
亲和层析操作 亲和层析应用

第一节 亲和层析基本原理
亲和层析定义

亲和层析是通过生物分子之间特异可逆 结合与解离的原理，进行生物分子特异 分离的层析技术。
亲和层析发展过程

在1968—1972年Anfinsen创建了亲和层 析技术。

交联葡聚糖
聚丙烯酰胺
稳定性较好
同上
孔径较小、稳定性不好
同上
琼脂糖
多孔玻璃
非特异性吸附低、稳定性好、 孔径均匀适当、宜于活化
机械强度好，化学稳定性好 活性基团较少、对蛋白 质有较强的吸附作用
二、配体的选择

可选择的配体有抑制剂、效应物、酶的 辅助因子、类似底物、抗体； 其他物质，如外源凝集素、polyA、 polyU、染料和金属离子。
五、分离大分子物质（洗脱）

除去杂质 样品过柱后，可用大量的平衡液即起始缓冲液洗去无亲和 力的杂蛋白，有时也可用不同的缓冲液洗涤去除之；
最后留在柱上的只有专一吸附的大分子物质。

洗脱有效成分 将柱上专一吸附的大分子物质洗脱下来。 洗脱液要能使复合物完全分离，其具体作法可根据亲和力 决定。



亲和层析常用的载体
纤维素 交联葡聚糖 琼脂糖 交联琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠 目前应用最多的是Sepharose4B，是由D-半乳糖 和3,6-脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖，基本能 符合理想载体的要求。

优点
纤维素
价格低、活性基团较多
缺点
非特异性吸附强、稳定 性和均一性较差

例如 实验现象： 葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，发现： 该标记物与酶活性中心的酪氨酸结合，
可导致酶活力丧失83％，剩余酶活力17％。

问题： 该实验的现象，
究竟是核酸酶的活性中心被结合后仍有17％的酶活力?
还是因为有少量的核酸未标记上而残存酶活力?

研究思路： 将标记和未标记的酶分离出来，进行活性检测。
思考题
1、什么是亲和层析？其原理是什么？ 2、亲和层析时，优良的配体应具备什么条件？ 3、亲和层析特异性吸附的影响因素有哪些？ 4、亲和层析操作洗脱时，根据亲和力大小的 不同，如何选择洗脱液？
亲和力较小时，可连续用大体积平衡缓 冲液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰。 亲和力一般时，主要改变缓冲液的性质 (如改变pH值或离子强度)，使复合物之 间的亲和力降到足以分离的程度。 亲和力较大时，可用与配体竞争的溶液 或者用蛋白质变性剂洗脱。
六、亲和层析柱的再生


当洗脱结束后连续用大量的洗脱液或高 浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，接着再用 平衡缓冲液使层析柱重新平衡。 经过这样处理的柱子可以再次上样，进 行第二次亲和层析。
生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应， 主要生成异脲衍生物
缺点： 非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。 与配体结合不够稳定 溴化氰有剧毒、易挥发，操作不便。

环氧乙烷基活化
活化后的基质都含有环氧乙烷基 ，可以结合含有伯氨 基(NH2)、羟基(OH)和硫醇基(SH)等基团的配体
优点 不引入电荷基团，与配体形成的N－C、 O－C 和S－C 键都很稳定，使用寿命长
缺点 与配体偶联时需要碱性条件，温度为20~40 ℃， 对于一些比较敏感的配体可能不适用
溴化氰偶联法为例，包括步骤： 活化 偶联 配体结合量的计算


1．活化基质
在一定量的贮存载体Sepharose 4B(即用布氏漏斗抽干的胶)中，加 入等量的蒸馏水和2 mol／L Na2C03溶液(pH 11~12)，混匀。 另将称量的固体 CNBr(50~300mg／g贮存胶)溶于二甲基甲酰胺溶 液中。随后迅速把此液加到搅拌的琼脂糖悬浮液内进行活化，其 pH值始终维持在11~12之间。 接着把冷却的反应液转到布氏漏斗中，用10~20倍凝胶体积的冷水 及0.07mol／L NaHC03溶液(pH8.5)洗涤。

3．配体结合量的测定
配体结合量：一般是用每毫升或每克贮存胶结合配体
的量表示的。如用mg／m1表示。
测得的配体结合量，可作为决定亲和吸附剂实际用量
的参数。

具体测定方法有两种，即直接测定法和间接测定法。
•
•
(1) ① ② (2)
直接测定法 2，4，6—三硝基苯磺酸钠的颜色试验 根据配体的特性进行测定 间接测定法

配体的分类
特异性配体
只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结 合的配体 如：抗原和抗体、酶和它的抑制剂
通用性配体
特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物 大分子结合的配体 如：凝集素可以结合各种糖蛋白
优良的配体须具备的条件
与待分离的物质有适当的亲和力 与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特 异性 与基质稳定的共价结合 自身应具有较好的稳定性
单克隆抗体 蛋白质A/蛋白 质G 蛋白酶抑制剂 磷酸 三嗪染料 抗生物素蛋白
胆固醇 脂肪酸 核苷酸 苯基硼酸 盐 凝集素 糖
三、亲和吸附剂的制备
1、载体的活化
指通过对载体进行一定的化学处理，使载体表 面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的 活性基团。 溴化氰活化法

环氧乙烷基活化法
溴化氰活化
四、特异性吸附


当样品开始加到已知具有一定配体浓度的亲和层 柱时，欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零； 当样品开始进入柱中时，配体和欲分离的大分子 物质间相互触，并形成复合物，当样品不断地通 过柱子，欲分离的大分子物质与配体之间形成的 复合物浓度越来越大。
特异性吸附影响因素


配体与欲分离物质的亲和力：亲和力大 时，吸附量大。 pH：随pH降低，吸附量减少。 离子强度：在相同pH条件下，离子强度 降低，吸附量反而增大。
亲和层析原理
生物分子之间特异性结合

抗原－－抗体
激素－－受体 酶－ － 底物、底物类似物、抑制剂、辅基 核酸－－互补链

第二节
亲和层析操作
配基
载体
一、载体的选择

理想的载体应满足下面的要求：
具有较好的物理化学稳定性 较多的活性基团 能够和配体稳定的结合 结构为均匀的多孔网状结构 与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 待纯化的蛋白质 配体 待纯化的蛋白质
抗原
特定单克隆抗体或多 克隆抗体
特定抗原 免疫球蛋白 蛋白酶 磷酸酶 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素 含生物素的酶
肝素
凝聚因子、脂酶、结 缔组织蛋白酶、DNA 聚合酶
胆固醇受体、胆固醇 结合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白 蛋白 核苷酸结合蛋白、需 核苷酸的酶 糖蛋白 糖蛋白 凝集素、糖苷酶
20世纪70年代有了惊人的发展，并逐步 得到广泛的应用。 目前，已有活化载体及其衍生物产品出 售，使得亲和层析变得更简捷。

亲和层析优点

其他方法利用理化性质的差异，许多分子
差异很小，要得到纯度高的单一分子，要
联合运用多种方法，最终得率低；

而亲和层析迅速、简单、高效、特异。
亲和层析缺点

要分离一种物质必须找到适宜的配体， 并将其制成固相载体之后方可进行。
•
•
•
•
通过活化反应形成的化合物可能有两种： 其一是具有反应能力的亚氨碳酸盐衍生物；
•
其二是无反应能力的氨基碳酸盐。

2．偶联
配体和~0.25mol／L碳
酸盐缓冲液(含0.5mol／L NaCl和1~10pmol配体／ml 基质溶液)混合，缓慢搅拌(勿用磁力搅拌器)2h(室温) 或过夜(4℃)，以便配体和基质充分偶联而形成固相载 体。