实验总结细胞培养方法公司内部档案编码：[OPPTR-OPPT28-OPPTL98-OPPNN08]一、培养细胞常用配置培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清依次比例酌量配置。
超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。
培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min二、细胞复苏步骤：1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
超净台内准备一支15ml离心管备用。
3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。
4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。
5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。
6. 取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。
7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
8. 将培养瓶放入培养箱内培养注意事项：1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套。
此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。
细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
4. 离心问题：目前主要有两种见解。
一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。
因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。
此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。
另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。
5. 冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液6. 复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般可分装到2-3只培养皿中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。
所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度8. 原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。
如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。
在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。
贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
三、培养液的更换1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
3. 将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖。
4. 将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸5．拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取5-10ml培养基再悬空移入培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次后盖上。
6. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
7. 将培养瓶放入培养箱内培养每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代。
四、细胞传代1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 培养液，胰酶，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
3. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
4. 将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。
取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。
5. 将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。
（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。
用移液器将胰酶吸净。
6. 吸取1ml培养基于培养皿内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。
7. 取1或2个新的培养皿，然后将细胞培养基均匀的分到2或3个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传2或1传3的培养。
8. 拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基皿内吸取5-10ml培养基悬空移入每个培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次盖上，在皿盖上做好实验标记。
9. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。
10. 将培养瓶放入培养箱内培养。
注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。
每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株。
五、细胞株的保存原理：细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。
胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。
如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。
实验步骤：选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。
将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。
适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。
用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。
悬浮生产细胞则不要消化处理。
然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。
加入冻存管中，再加入1ml配置好的冻存液后放入梯度降温盒，放入-80℃冰箱中。
1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2. 培养液，胰酶，二甲基亚砜DMSO，胎牛血清（解冻），梯度降温盒恢复常温，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。
3. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
4. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。
取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。
5. 将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。
取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。
6. 将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。
（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。
用移液器将胰酶吸净。
6. 吸取1ml培养基于培养皿，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。
7. 将悬浮细胞吸入15ml离心管内，加入4ml培养基离心1000r/min，5min8. 预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。