总结---细胞培养
一．基本理论概论
原代培养: 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。

传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。

细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。

(如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。

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细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。

培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。

细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长
培养细胞的形态（形态不一定，环境改变形态可能改变）：成纤维性型细胞，上皮型细胞（单层膜样生长），游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起）
二．培养过程及要点（切记无菌操作）
（一）工作环境的处理
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。

实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。

操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。

实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。

3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。

勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。

容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

吸管口切勿碰到容器瓶口
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。

对于来自人类或是病毒
感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。

操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。

5. 定期检测下列项目：
CO2 钢瓶之CO2 压力。

CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。

（二）试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌
清洗：
（1）玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置）
浸泡—刷洗—浸酸—冲洗
（2）胶塞的清洗
刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。

2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用
（3）塑料制品的清洗
2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。

消毒：
（1）物理消毒法（紫外线，湿热，烘干，过滤）含碳酸氢钠溶液要过滤，高压会分解，培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃, 15 磅, 20 分钟；布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干热灭菌170℃, 4 小时。

（2）化学消毒法（70%酒精，千分之一的新洁尔灭）
（3）抗生素：培养用液灭菌或预防培养物污染
（三）培养物的污染及控制
污染种类：
（1）细菌污染：培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。

污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。

（2）真菌污染：培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。

（3）支原体污染：培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。

但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。

（4）病毒污染：尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。

因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

（5）非同种细胞污染：
污染来源：
（1）不洁的动物组织标本：正常情况下组织来源是不带菌的，但由于取材不小心也会染菌，也有可能动物体本身带菌，不用浓的抗生素清洗，会导致培养污染。

（2）空气：如果无菌操作区与外界隔离不严，空气中会带菌。

其次，超净台使用过久，滤板堵塞也会污染。

工作时不带口罩外界气流过强会污染。

再者，南方空气潮湿，空气中容易带菌，操作不注意会染菌。

（3）清洗消毒：培养用液除菌不彻底，培养器具清洗消毒不彻底。

（4）操作不过关
1、实验前未检查器械和液体是否污染
2、操作者未带口罩帽子，呼出空气中含细菌和支原体
3、培养瓶未用75%酒精擦拭和灼烧
4、操作不当吸管或培养用品接触到污染物，如皮肤，瓶壁
5、操作者说话大声，来回走动，扬起灰尘。

预防和控制
污染是细胞培养的大敌。

预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。

细胞培养细胞一经污染，多数较难处理。

如果污染细胞价值不大，宜弃之；在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。

预防
1、培养用液、器皿要清洗消毒，防止污染。

无菌室无菌器械要定期消毒
2、操作者要细心稳重。

进入无菌是前要用肥皂洗手，穿好隔离衣帽口罩，检查物品无污染。

进入室内要少说话走动打喷嚏要向背后，用酒精棉球擦手，瓶口，并灼烧瓶口。

用酒精擦台面，在超净台中央操作，切勿一根吸管用到底，要更换吸管，操作时吸管不能碰到培养瓶口，防止污染，试验完成要做好标记。

临走带走物品，用酒精擦台面。

不可直接进行下一个试验。

3、防止细胞交叉污染，及早留种保持，防止污染
控制
（一）、使用抗生素：一般对细菌有用。

预防用药比污染后用药好，联合用药比单独用药好。

一般用青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml，清除用药是常量的5-10倍采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养物，有时可能奏效。

抗生素常用量和效果如果下：
抗生素细菌真菌支原体常用量
青霉素G＋100u/ml
链霉素G－100ug/ml
庆大霉素G+/G- 200ug/ml
四环素G+/G- 10ug/ml
卡那霉素G+/G- 50ug/ml
两性霉素B + 2ug/ml
制霉菌素+ 25ug/ml
(二)、加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的细胞至于41摄氏度作用5～10h（最长可达18h），以杀灭支原体。

但41摄氏度对细胞本身也有较大影响，故在处理前应先进行预实验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的最佳处理时间。

（三）、使用支原体特异性血清：抗血清结合支原体。

一般支原体污染无太大价值均弃掉。

（四）、其他方法：动物体内接种除菌，加巨噬细胞。

动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤细胞进行培养。

与巨噬细胞共培养：巨噬细胞在体外可存活7～10天，并保持吞噬、消化微生物的能力。

利用这一特点，可将少量的污染细胞与足够量的巨噬细胞共培养，从而消除污染。