细胞培养学习总结
--贴壁细胞培养技术
一、细胞培养一般流程：
㈠、复苏：
1、实验前做好相关准备工作（水浴锅37℃；超净工作台的无菌环境；准备
好实验相关仪器和试剂）。

2、把冻存管从液氮灌中取出来，立即投入37℃（≦40℃）水浴锅中，晃动
冻存管，使液体在1min以内全部融解（关键步骤），用酒精棉擦拭其外壁，放到超净工作台里。

3、把上述细胞悬液吸到15ml的离心管中，加入适量培养基，(用培养基把
冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来，转移时不要直接倒，以防污染)，1000转离心1-3min（可根据所培养细胞调整）。

4、吸弃上清液，加适量培养基把细胞吹散成细胞悬液，转移到培养瓶中，
加适量完全培养基（常为覆盖培养瓶底面即可）。

5、标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴
壁后再换培养基。

6、注意观察细胞生长状态，及时换液或传代。

㈡、换液：
1、实验前做好相关准备工作（超净工作台的无菌环境；准备好实验相关仪
器和试剂）。

2、取出培养瓶，用75%酒精消毒后放入超净实验台。

3、吸弃旧培养液，用适量（如2ml）PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞（可根
据细胞状态洗1-2遍，一般从没有细胞的那一侧倒掉）。

4、加入适量新鲜完全培养基，放回培养箱继续培养。

㈢、传代：
1、实验前做好相关准备工作（超净工作台的无菌环境；准备好实验相关仪
器和试剂）。

2、取出培养瓶，用75%酒精消毒后放入超净实验台。

3、吸弃旧培养液，用适量（如2ml）PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞（可根
据细胞状态洗1-2遍）。

（前面步骤同换液）
4、加适当的胰蛋白酶（0.05%）(能覆盖细胞就行)，放入细胞培养箱中消化
1-2min（根据不同类型细胞而定）。

5、细胞都变圆后加如入等体积的完全培养基终止消化。

6、用滴管缓慢吹打细胞，使细胞都悬浮起来成细胞悬液，吸到15ml的离心
管中，1000转离心1-3min。

7、倒掉上清液，加1-2ml完全培养基，将细胞吹散成单个细胞。

8、根据细胞浓度把细胞传到几个培养瓶中，加入适量完全培养基（一般癌
细胞一个培养瓶分2个），放回培养箱中继续培养。

㈣、冻存：
1、实验前做好相关准备工作（预先配置好冻存液放入4℃保存，常为
10%DMSO+90%血清，配制过程中加入DMSO要缓慢，且边滴边摇；超净工作台的无菌环境；准备好实验相关仪器和试剂）。

2、取出培养瓶，用75%酒精消毒后放入超净实验台。

3、吸弃旧培养液，用适量（如2ml）PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞（可根
据细胞状态洗1-2遍）。

4、加适当的胰蛋白酶（0.05%）(能覆盖细胞就行)，放入细胞培养箱中消化
1-2min（根据不同类型细胞而定）。

5、细胞都变圆后加入等体积的完全培养基终止消化。

6、用滴管缓慢吹打细胞，把细胞都悬浮起来成细胞悬液，吸到15ml的离心
管中，1000转离心1-3min。

（同细胞传代中步骤）
7、倒掉上清液，加入预制的冻存液制成细胞悬液，分装到灭菌的冻存管中，
（注意不要加满，预留其结冰后的空间，一般1.8ml的冻存管加入≦1.5ml 的细胞悬液）。

8、写明细胞种类、冻存日期。

放入4℃冰箱30min，-20℃冰箱30min，-80℃
冰箱过夜，最后放入液氮罐中保存。

一、细胞培养注意事项：
注意无菌操作，以防细胞污染，定期检查培养箱、超净台，按时观察细
胞状态，实验过程中注意保护自身安全。

㈠、注意无菌操作
1、实验进行前，超净工作台以紫外灯照射30-60 min灭菌，并开启操
作台风扇运转30min后，才开始实验操作。

2、实验进行前，实验人员应穿戴好实验服，口罩，手套。

3、所有拿进实验台的物品都应用75%酒精消毒。

4、在酒精灯10cm内进行操作，开盖或封盖前应用酒精灯灼烧灭菌，
但注意对有滤膜的培养瓶不应灼烧，以免细胞污染。

5、每次尽量只处理一个细胞株，以免发生细胞间污染。

6、实验结束后，处理好废液，用75%酒精擦净台面，开启紫外，照射
5min以上。

㈡、定期检查项目
1、培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，
每周更换)。

2、CO2钢瓶之CO2压力。

3、超净工作台内之气流压力，定期更换紫外线灯管及HEPA （高效空
气净化）过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

㈢、观察细胞状态：
1、正常状态下，细胞贴壁生长，当培养液颜色变淡时，应换液。

对于
培养基中添加酚红指示剂的，若紫色变深，则应检查CO2供应，若
颜色变黄，则可能是换液或传代频率太低。

2、当培养瓶中细胞覆盖率达80%以上时，应传代。

3、若发现很浑浊，且有许多漂浮死细胞时，可能细胞被污染，应丢弃
被污染细胞并对培养箱进行灭菌操作。

二、所需设备
CO2培养箱（最好是内置紫外灯）；超净工作台；倒置显微镜；液氮罐；
低速离心机；恒温水浴锅；冰箱（-80℃）、（4℃及-20℃）；高压灭菌锅；
电热鼓风干燥箱；
三、所需仪器及试剂及易耗品
1、仪器：培养瓶（最好是带滤膜）；酸缸；滴管；胶头；离心管（15ml、
50ml）；酒精灯；打火机；废液缸（烧杯500ml）；冻存管；封口膜；
镊子；标记笔；棉花；
2、试剂：基础培养基（RTMI-1640培养基；MEM培养基；DMEN培养
基；无血清培养基等）；血清（小牛血清、胎牛血清、马血清等）；
胰酶(trypsin-EDTA solution)；PBS（磷酸缓冲盐溶液）；DMSO（二
甲基亚砜）；双抗（青霉素钠+链霉素）；
3、易耗品：手套（透明手套；橡胶手套）；口罩；（另白大褂）
四、仪器回收利用：
滴管、离心管清洗流程，
1、滴管清洗过程:
酸泡（1星期）--清水冲洗（20遍）--超声洗涤20min（2遍）--去离
子水冲洗（10遍以上）--晾干—烘箱干燥—高压灭菌—烘箱干燥
2、离心管清洗过程
洗衣粉水泡（1星期）--清水冲洗（10遍以上）--去离子水冲洗（10
遍以上）--晾干—烘箱干燥—高压灭菌—烘箱干燥。