实验一硫酸铜标准曲线的制作
一、目的与要求
1、掌握分光光度比色法的基本原理和应用；
2、熟悉标准曲线的意义及掌握制作方法；
3、了解光谱光度法技术的具体内容及应用；
4、了解回归分析法。
二、原理
光电比色法是根据溶液颜色深浅的比较来测定物质含量的一种方法。
因此，在原理上应用了有色溶液对光吸收的物理定律即Lambert-Beer定律。
常用的光电比色法：
1．标准曲线法：分析大批样品时，采用此法比较方便，但需要事先制作一条标准曲线（（或称工作曲线），以供一段时间使用。
配制一系列浓度由小到大的标准溶液，在溶液吸收最大的波长下，测出它们的吸光度。
在标准溶液的一定浓度范围内，溶液的浓度与其吸光度之间呈直线关系，即被测物质对光的吸收符合Lambert-Beer定律，则必然会得到一条通过原点的直线，即标准曲线（见图1）。
以各标准溶液的浓度为横坐标，相应的吸光度（A）为纵坐标，在方格坐标纸上绘出标准曲线，在制作标准曲线时，测出的数据至少要有三个落在直线上，这样的标准曲线方可使用。
比色测定待测样品时，操作条件应与制作标准曲线时相同。
测出吸光度后，从标准曲线上可以直接查出它的浓度，并计算出待测物质以后只要测定条件不变，将测出的样品溶液吸光订值代入该回归方程式，则可计算出样品溶液的浓度。
2．标准管法（即标准比较法）：在相同的条件下，配制标准溶液和待测样样品溶液的有色溶液，并测定它们的吸光度。
由两者吸光度的比较，可以求出待测样品溶液的浓度。
待测样品溶液的浓度=待测样品溶液的吸光度
×标准溶液的浓度标准溶液的吸光度
3．标准系数法（即计算因数法）：此法较上两法更为简单。
将多次测定标准溶液的吸光度算出平均值后，按下式求出标准系数。
标准系数=
标准液浓度标准液吸光度
4．回归分析法：将制作标准曲线的各种标准溶液浓度的数值，与其相应的吸光度值，
用数理统计中的回归分析法求出一个回归方程式。
以后只要测定条件不变，将测出的样品溶液吸光度值代入该回归方程式，则可计算出样品溶液的浓度。
三、操作与计算
1．硫酸铜贮备标准液的配制（含铜量20000μg/ml）:精确称取CuSO4·5H2O ，置于100ml 烧杯中，用L硫酸溶解后，移入500ml容量瓶中，用少量L硫酸冲洗烧杯3次，洗液一并转入容量瓶中，用L硫酸稀释至刻度，将该液放置阴凉处，如发现沉淀混浊，应重新配制。
2．应用标准液的配制：用5ml移液管，按下表要求，将硫酸铜贮备标准液用L硫酸在中号试管内稀释，摇匀，置阴凉处备用。
编号应用标准液浓度
（μg/ml）
贮备标准液
（20000μg/ ml，ml）
L硫酸
（ml）
11000
22000
33000
44000
3．绘制硫酸铜标准曲线：分别从编号试管中，吸取硫酸铜应用标准液，加到光径1cm 的比色杯中。
用分光光度计，以L硫酸作空白调零点，在690nm波长处，测定1-4号试管中溶液的吸光度（A）；每一溶液重复测3次，取其平均值，以各试管浓度为横坐标，各试管溶液的吸光值为纵坐标，用坐标纸绘制出硫酸铜标准曲线。
4．未知硫酸铜溶液浓度的计算：取未知硫酸铜溶液加入比色杯中（若过浓可稀释5-10倍），用分光光度计，在690nm波长处测定吸光度。
以此吸光度值可在硫酸铜标准曲线上查出未知硫酸铜溶液的浓度。
思考题：
1．标准曲线是如何设计的，有何临床意义
2．未知硫酸铜溶液的浓度是如何求出的
3．何谓回归分析法
（库热西·玉努斯）
附：光谱光度法分析技术
利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系（带、线）的特征，来确定该物质的性质、结构和含量的技术称为光谱光度分析技术。
光谱光度分析技术包括发射光谱分析、吸收光谱分析和散射光谱分析三大类，与其对应的仪器列表如下（表1）：
表1 光谱光度分析与其对应的仪器
光谱分析类型
对应仪器名称
发射光谱
1、各种摄谱仪
2、火焰光度法
3、原子荧光光谱仪
4、荧光比色计 吸收光谱
1、各种光电比色计
2、各种可见光区及紫外光区分光光度计
3、各种红外光区分光光度计
4、原子吸收分光光度计 散射光谱
1、各种浊度计
2、各种乳光计
3、各种生物光度计
生物体内有许多物质成分含量甚微，不能用重量分析法或溶量分析法去测定，而常用比色法来测定，该法灵敏、迅速、准确，是当前常用的一种定量分析法。
一、比色法原理
比色法是根据溶液颜色深浅的比较来测定物质含量的一种方法，在原理上应用了有色溶液对光吸收的物理定律——Lambert-Beer 定律。
Lambert 定律：
一束单色光线通过一有色溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，透过光的强度就会减弱。
若溶液的浓度不变，溶液的厚度越大（即在溶液中所经过的途径越长）。
透过光的减弱也越显著。
若I 0=光线通过溶液前的强度（入射光强度） Ⅰ=光线通过溶液后的强度（透过光强度） b=溶液的厚度 则 ……①
常数K1的数值随光线的波长和溶液的性质而改变。
Lambert 定律适用于一切溶液（图
2）。
Beer 氏定律：
一束单色光线通过一有色溶液后，透过光线强度就会减弱。
若溶液的厚度不变，则溶液的浓度越大，透过光线强度减弱就越显著。
若C=溶液的浓度
……………②
Ⅰ。
Ⅰ
图2
Beer 氏定律并非适用于一切溶液，有的溶液若浓度改变，溶质的解离或聚合的程度也随着改变。
若两种溶液是由同一种物质配成，则k 1= k 2，合并①及②式：则得下式：
……………………………③
③式中
可用T 表示，T 称为透光度。
设A 或OD 称为吸光度(或称光密度或称光密度)，则有－LogT=A （OD ） A=KCb …………④
依照④式，以相同方法配制含有同一种物质的两种不同浓度的溶液，设标准液浓度为C 1，厚度为b 1，未知液浓度为C 2，厚度为b 2，可以写出以下两式：
标准液A 1=K 1C 1b 1…………⑤ 未知液A 2=K 2C 2b 2…………⑥
因溶液由同一物质配成，所以K 1=K 2。
在比色时，溶液厚度是固定的（用同一规格比色杯，一般厚度为1cm ），b 1=b 2，用⑤式除以⑥式则得：
=…………………………………⑦
求C 2，则有：C 2 =
×C 1 =
例：血糖测定实验中，葡萄糖
标准液ml ，操作中用了1ml ，测定管用血量为，求100ml 血液中葡萄糖的毫克数
=
×××100
二、吸光度的测定
当一定波长的光线透过溶液后，照射到光电池上，光电池可将光能转变成电能，产生光电流。
产生光电流的大小可通过检流计指针的偏移距离来表示。
在比色计的刻度盘上，可以直接读出吸光度。
三、光波波长与滤光
光线的本质是电磁波的一种，有与电磁波和X 线类同的性质。
光线有不同的波长，肉眼可见彩色光称为可见光，波长范围在400~750nm ，小于400nm 的光线称为紫外线，大于750nm 的光线称为红外线，如表所示（表2）。
表2 光波波长与区带
未知液吸光度 ×标准溶液浓度 ………………⑧
标准液吸光度
血糖mg%= 测定管吸光度 ×标准液实际含量×扩大100ml 血所需数据
标准管吸光度
测定溶液介质不同，对光线有不同的吸收作用。
一种介质仅对某一种波长的光线具有最大吸收能力，利用这种特性来测定该物质的浓度最为灵敏。
如果溶液中还有其它吸收光能的物质存在时，可选用一定波长滤光片，让这种物质对此波长吸收能力最小，从而可以减少它的干扰作用。
换言之，入射光为单色光为佳。
表3 滤光片选择参考表
λ（nm）滤光片颜色测定介质颜色
400～435青紫黄绿
435～480蓝黄
480～490蓝绿桔红
490～500绿蓝红
500～560绿紫
560～580绿黄蓝紫
580～595黄蓝
595～610桔红蓝绿
610～750红绿蓝为达到入射光为单色光之效果，在仪器制作时增加了选择光源、单色器透镜聚光、棱镜色散、过狭缝等多个技术环节，以求达到其吸光度值与被测物质含量呈正相关之最大准确性。
以72-1分光光度计为例介绍其结构组成特点（图2-2）
1、光源灯
2、透镜聚光
3、色散棱镜
4、准直镜 5和12、保护玻璃 6、狭缝
7、反射镜 8、光栏 9、聚光透镜 10、比色杯 11、光门 12、光电管
应用电灯（钨灯）射出的光通过三棱镜折射到白纸上，色散成红、橙、黄、绿、兰、靛、紫组成的一幅色谱，这就是发射光谱。
不同的光源（如太阳灯、日光灯、氢灯、汞灯以及原子与分子燃烧时所发射的光等）通过三棱镜所色散出来的色谱是不同的，也就是说，它们有各自独特的发射光谱。
因此，可以通过发射光谱来鉴别发光体的组分；也可以采用不同的发光体所发射出的光谱作为有关仪器的光源。
钨灯能发出400~760nm波长的光谱，故可采用钨灯作为可见光分光光度计的光源，氢灯能发出185~400nm波长的光谱，故可采用氢灯作为紫外分光光度计的光源。
思考题：
1．何谓光谱光度法技术
2．光谱光度法包括哪些技术
3．721分光光度计的结构原理是什么可见光的光谱波长和紫外光的光谱波长范围各是多少。