盒 式 诱 变
人工合成 具有突变 序列的 DNA片段
野生型基因
应用：SOD酶化学修饰研究：
天然的SOD 稳定性较差，具有免疫原性，功能相 对单一，而限制了其应用，化学修饰可以增强酶稳 定性，降低免疫原性。 2003 年，赵数进，尹亮等用相对分子量为 2000~20000的PEG 修饰SOD，发现相对分 子量为6000 的PEG 修饰效果好 1986 年，袁勤生等用高碘酸钠氧化右旋糖酐成 二醛修饰SOD, 实验表明，修饰酶不仅完全保留了 天然酶的活性，而且在耐热性、耐酸性，抗胃蛋白 酶水解的能力等方面明显优于天然酶。
GCC
+ polymerase
CAG GCC
(4)
translation
Thr
Juang RH (2004) BCbasics
Mutant protein
replication
Smith (1993)
Only one amino acid changed Val → Thr
寡核苷酸定点突变
(2)PCR介导的定点突变
结果
定点突变后3个质粒测序结果及突变前后序 列对比3个质粒的测序结果有2种，分别和文 献的Cu，Zn-SOD序列对比： 其中1个质粒测序结果和Cu,Zn-SOD基因 序列完全一致，说明突变未成功； 另外2个质粒分别有2个碱基和Cu,Zn-SOD 因序列不同，也就是Cys的密码子TGC变成 了Ala的密码子GCC，其他序列与Cu，ZnSOD基因一致，符合预期要求。
利用酶作为催化剂进行生物催 化与生物转化，已成为生产精细化 学品、手性药物、食品添加剂等的 重要工具,获得了广泛应用。
天然酶的局限-源于酶的自然进化过程
天然的生物催化剂存在着无法适应工业化生产中非 自然条件的限制天然酶用于工业生产 不能很好地适应环境的转变，较差的溶解性不稳定 性以及苛刻的酶促反应条件使其不适于大规模应用 酶在活细胞的复杂条件下，底物或产物之一可能 会强烈抑制酶生物催化过程的活力 在非水溶液中酶不能够接受不同的底物
SOD酶化学修饰研究：
有关SOD 化学修饰开展的工作，用来作为 修饰剂的分子有脂肪酸、糖、蛋白质及维生 素等, 但未发现用激素作为修饰剂。 有报道：褪黑素MT，化学名称为N-乙酰5-甲氧基色胺，，研究表明它是一种抗氧化 剂，可有效清除化学反应中产生的羟自由基。 修饰酶MT－SOD， 保留SOD 的歧化活性 的同时，也具备MT 清除自由基的能力以及 MT其他的生理功能。
Point Mutations(碱基替代)
5’…T-A-C…..3’ 3’...A-T-G……5’ A-A-C T-T-G T-A-G A-T-C T-A-T A-T-A T-A-C A-T-G Transcription A-A-C
Aspargine codon
Gene Replication 基 因 定 点 突 变
引物
A G A G T A
N 体定突 图21- D A的 外 点 变
寡核苷酸定点突变基本原理
★利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物， 利用M13噬菌体载体系统合成突变基因。 ★首先将待诱变的基因克隆在M13噬菌体载体上， ★另外，人工合成一段改变了碱基顺序的寡核苷酸片 段（8~18bp），以此作为引物，在体外合成互补 链， ★再经体内扩增基因，经此扩增出来的基因即是突变 了的基因。
SOD酶化学修饰研究：
1994 年，阎家麟、谢文正等用被氯化亚砜活化 的月桂酸修饰牛血Cu,Zn-SOD ，其活性回收率 为93%，修饰率为80%，半衰期明显延长，蛋 白质的免疫原性降低，热稳定性及抗蛋水解酶的能 力也明显增强。 1996 年，邹国林，胡萍等用膜脂成分的硬脂酸 作为修饰剂，对SOD 进行化学修饰。修饰SOD 对温度、pH、蛋白酶水解的稳定性比天然SOD 增强，且免疫原性消除，在低浓度的某些有机介质 中活性比在水中高。
在最初所建立的 PCR 方法中 就可看出只要引物带有错配碱 基，便可使 PCR 产物的末端 引入突变。但是诱变部位并不 总在 DNA 片段的末端，有 时也希望对靶 DNA 的中间 部分进行诱变。 目前采用重组 PCR 进行定位 诱变，可以在 DNA 片段的 任意部位产生定位突变。
PCR介导的定点突变
定向进化技术
人为地创造特殊的进化条件，模拟自 然进化机制，在体外对基因进行随机突 变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天 然的或者人为获得的）出发，经过基因的 突变和重组，构建一个人工突变酶库，通 过一定的筛选或选择方法最终获得预先期 望的具有某些特性的进化酶。
PCR定点突变
整个反应体系为50μl，其中含无菌去离 子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、 P2引物各1μl，pESOD质粒1μl(约 100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反应 条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性 1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25个 循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
SOD酶基因定点突变修饰研究：
铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD) 在体 内停留时间短(通常只有6～10min)，使 得Cu，Zn-SOD的应用受到很大限制。 本研究采用一种近年来新的定点突变技术― 快速PCR定点突变方法成功地对Cu，ZnSOD进行了基因改良，将Cu，Zn-SOD基 因中非活性中心的Cys111密码子突变为 Ala密码子，以提高其稳定性。
U-A-G
Stop codon
U-A-U
Tyrosine codon
U-A-C
Tyrosine codon
m-RNA
Translation Normal Wild type
Missense
Incomplete Normal Nonsense Silent
点 突 变 的 结 果
碱基替代
碱基替代
碱基替代插入或缺失
需要4条PCR引物:分 别是含有突变的碱基并 且反向部分重叠的引物 A,A’,以及与目的基因两 端互补的引物B,C. 任何基因，只要两端 及需要变异的部位的序 列已知，就可用 PCR 诱 变去改造基因的序列。
PCR介导的定点突变
首先,引物A, B和A’ ,C两 两配对,分两管进行第一次 PCR,产生两个部分重叠的 DNA片段. 然后将上述两管PCR产物 混合,变性再复性,在DNA 聚合酶的作用下延伸产生 完整的双链DNA, 用引物B,C,以新合成的完 整双链DNA为模板进行第 二次PCR,即可得到含有预 期突变位点的DNA片段.
第五讲
基因定点突变和酶定向进化技 术及应用
一 基因定点突变技术及应用
1 体外定点突变技术的目的
基因定点突变是指按照设计的要求，使基因的特定 序列发生插入、删除、置换和重排等变异。 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的 关系的有力工具。 蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定 碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应 的氨基酸序列和蛋白质结构和功能,改造酶的不同 活性或者动力学特性
寡核苷酸定点突变
1）在克隆外源基因时，需要从已感染 M 13 的大肠杆菌细胞中获取含有 M 13 双链复制型 DNA ，将外源基因插 入到M 13 DNA 中； 2）在定点诱变时，需从培养液中分离 出 M 13 的重组噬菌体，并从中提取携 带外源基因 M 13 的单链重组 DNA 。 3）再进行体外定位诱变，人工合成一 段改变了碱基顺序的寡核苷酸片段 （8~18bp），以此作为引物，在体外 合成互补链，获得含有错配碱基的完整 双链 M 13 DNA ， 4）双链 M 13 DNA转染大肠杆菌， M 13 在大肠杆菌中扩增，形成噬菌斑。 理论上一半是野生型，另一半则含有突 变基因。用诱变的寡核苷酸引物作为探 针，通过杂交即可鉴定出突变体。
Site-directed mutagenesis
Wild type
CAG GTC
(1)
CAG GTC 重组 DNA 野生双链
(5)
translation
Val
CAG
(2)
Wild type protein + primer
CAG CGG 突变引物 GCC 突变双链
(6)
Mutant
primer
(3)
2 体外定点突变的方法
具体方法有三种： (1)寡核苷酸介导的定点突变 (2)PCR介导的定点突变 (3)盒式突变
（1）寡核苷酸介导的定点突变
寡聚核苷酸定点 诱变技术是由加 拿大的生物化学 家（michael smith，1932-） 发明的。
寡核苷酸定点突变基本原理
合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作 为引物，其中含有所需要改变的 碱基，使其与带有目的基因的单 链 DNA 配对。 合成的寡核苷酸引物除短的错配 区外，与目的基因完全互补。 然后用 DNA 聚合酶使寡核苷酸 引物延伸，完成单链 DNA 的复 制。 由此产生的双链 DNA ，一条链 为野生型亲代链，另一条为突变 型子代链。 将获得的双链分子通过转导入宿 主细胞，并筛选出突变体，其中 基因已被定向修改。
1993年,美国科学家Arnold F H 首先提出酶分子的定向进化的概 念，并用于天然酶的改造或构建新 的非天然酶。
定向进化（Directed evolution）是近20年发 展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想 在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用 它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在 实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过 程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生 大量变异，并定向选择出所需性质的突变体， 可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成 的进化过程
菌株与质粒
E.coli DH5α，由本实验室保存 质粒pESOD(含Cu，Zn-SOD基因、Ampr 基因以及EcoRI酶切位点，整个质粒约 33kb)，由实验室构建，并转化于E.coli DH5α保存。