根据我们所学的知识，你有几种方 法把两个DNA片段定向连接起来？
先用同种限制性核酸内切酶切，使 两段DNA片段中需要连接的一端形 成相同的黏性末端； 然后再用相应的DNA连接酶将两个 黏性末端连接起来。 直接用DNA连接酶将两个片段连 起来。
合适酶切位点及相应的DNA限制酶比 较难找
连接时没有方向性。
先让我们回顾一下PCR的原理（简化）
PCR后的产物中包括目的基 因和引物尾部的碱基对
a b
5’ 3’ DNA1 PCR
3’5’ 5’3’ DNA2 PCR 3’ 5’ 5’ 3’ 升温 退火 3’ 5’
3’ c 5’ d
a 5’ b 3’c d源自a5’3’
3’
5’
d
延伸
5’ 3’
3’ 5’
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法 向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒） 中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化）， 包括碱基的添加、删除、点突变等。
给一段DNA:
A T
要求：把其中的A-T碱基对定点突变成为G-C碱基 对 首先： 先“去除”A-T碱基，得到两段 DNA
a b
5’
3’ C
3’ 5’
5’G 3’
3’ c
5’ d
DNA1
PCR
DNA2
PCR
a 5’ b 3’ 5’ 3’
G C G C
3’ 5’ 3’ 5’ 升温 退火 c d
a 5’ 3’
G C
3’ 5’ d
延伸
5’ 3’
G C
3’ 5’
各约15个bp
添加
删除
点突变
Thinking……
其实，不管是碱基对的添加、删除还 是点突变，我们都可以将需要突变的 部位当成是断开的就行了。
添加：将基因中需要添加碱基对的部位看成断 开，在引物中加入需要添加的碱基即可 删除：将基因中需要删除的碱基对看成没有 即可
点突变：综合添加和删除，即将基因中需
要突变的基因看成没有，将需要的碱基对加 入引物中