1 材料与方法
111 材料 11111 菌株
蜡状芽孢杆菌 kd202,本实验室筛选 。 11112 斜面培养基
蛋白胨 1510 g, 甘油 5010 g, NaC l 410 g, 011% FeSO4 ( FeSO4·7H2 O )溶液 015 mL ,柠檬酸钠 5188 g, 20% M gSO4 (M gSO4·7H2 O ) 1 mL , K2 HPO4 410 g,牛 肉膏 310 g,将上述各组分混合加水配成 1 000 mL溶 液 ,调 pH 至 710～712,分装于 500 mL锥形瓶内 ,每 瓶 80 mL ,在 115 ℃灭菌 30 m in。 11113 青霉素菌渣
收稿日期 : 2008 - 11 - 19 基金项目 :国家科技支撑计划资助项目 (2007BA I26B01) 作者简介 :刘慧娟 (1982—) ,女 ,河北沧州人 ,硕士研究生 ,研究方向 :发酵工程 ;王丽丽 (联系人 ) ,教授 , E2mail: wanglili@ hebust. edu. cn
检测 取青霉素菌渣 500 g,加纯净水 750 mL搅拌均 匀 ,室温放置 15 m in,加入已知浓度的酶量适量 ,反 应 1 h后 , 9 000 r /m in离心 ,上清液经 0122 μm微孔 滤膜 过 滤 后 , HPLC 检 测 滤 液 中 的 残 留 青 霉 素 效价 。
2 结果与讨论
青霉素的降解 11511 H PLC 检 测 青 霉 素 菌 渣 中 残 留 青 霉 素 的 色
谱条件 N2010 色 谱 工 作 站 ; ApolloC18 色 谱 柱 5μm , 416 mm ×25 cm; 流 动 相 V (乙 腈 ) ∶V (磷 酸 二 氢 钾 ) = 26∶74;流速 115 mL /m in;检测波长 225 nm;灵 敏度 0101AUFS;柱温 (26 ±1) ℃;进样量 20μL。 11512 青霉素钠标准曲线的制作 准确称取青 霉素 钠对照 品 110 g, 置于 50 mL 容量瓶中 ,加水溶解并稀释至刻度 ,配成含青霉 素钠 20 m g /mL的溶液作为贮备液 。分别精密吸 取该贮 备 液 1125、215、5、715 mL , 各 置 于 50 mL 容量瓶中 ,用水稀释至刻度 ,即得系列对照品溶 液 。经 0122 μm微孔 滤 膜 过 滤 , 用 H PLC 测 其 吸 收峰面积 ,以测定的吸收峰 (A ) 为纵坐标 ,相对 应的青霉素钠质量浓度 (m g /mL )为横坐标 ,绘制 出标准曲线 。 11513 青霉素酶降解青霉素菌渣后残留青霉素的
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生 物 加 工 过 程
第 7卷
表 1 青霉素菌渣中残留青霉素及 N、P、K测定结果 Table 1 Summary of the N、P、K concen tra tion and the
第 7卷第 5期 2009年 9月
生 物 加 工 过 程 Chinese Journal of B iop rocess Engineering
doi: 10. 3969 / j. issn. 1762 - 3678. 2009. 05. 011
Vol. 7 No. 5 Sep. 2009
石药集团河北中润制药有限公司提供 。 112 方法
青霉素菌渣总 N 的测定 ,方法参考文献 [ 3 ]。 青霉素菌渣总 P的测定 ,方法参考文献 [ 4 ]。 青霉素菌渣总 K的测定 ,方法参考文献 [ 5 ]。 113 青霉素酶的制备 取蜡状芽孢杆菌的斜面ห้องสมุดไป่ตู้养物 ,接入种子培养 基 , 28 ℃摇床培养 18 h, 接入发酵培养基 , 接种量 10% ,同 时 每 瓶 加 入 无 菌 青 霉 素 015 万 单 位 , 在 28 ℃摇床培养 24 h,再加无菌青霉素 1 万单位 ,培 养 48 h,再加无菌青霉素 115 万单位 , 72 h发酵结 束 , 离心收集上清液 ,再经 0145、0122μm膜过滤 , 滤液为无菌青霉素酶液 , 4 ℃贮存备用 。 114 青霉素酶的检测 青霉素酶活定义为 :在 37 ℃的水浴下 , 1 mL酶 液 1 h内降解的青霉素差值效价单位数 。 11411 青霉素钠标准曲线 取 110 g青 霉 素 钠 溶 于 柠 檬 酸 钠 2盐 酸 缓 冲 液 ,用 100 mL容量瓶定容 。从母液中分别取 50、 100、150、200、250、300 μL加 缓冲 液至 1 mL。分 别加 入 01125 mo l/L中 性 羟 胺 1 mL和 95 % 乙 醇 110 mL反 应 3 m in后 , 加 入 0125 mo l /L硫 酸 铁 铵 2101 mL ,待 反 应 液 中 气 泡 消 失 后 测 OD 值 [ 5 ] 。 用 OD 值作纵坐标 ,青霉素钠作横坐标绘制标准 曲线 。 11412 青霉素酶活力的检测 将酶稀释液 ( 5 000 ～6 000 U /mL ) 1 mL与青霉
将废菌 丝 送 焚 烧 厂 进 行 焚 烧 , 以 达 到 无 害 化 处 理 [ 1 ] 。这样不仅容易造成环境污染 ,也会直接导致 资源的浪费和潜在经济损失 。采用其他方法处理 青霉素干菌渣中的残留青霉素也未被报道 。
笔者所在实验室筛选的 1株高产青霉素酶的蜡 状芽孢杆菌 kd202。因其能专一水解青霉素的β2内
青霉素酶在青霉素菌渣无害化处理中的应用
刘慧娟 1 ,王丽丽 2 ,邓凯顺 3 ,仪 宏 1
(1. 河北科技大学 生物科学与工程学院 ,石家庄 050018; 2. 河北省发酵工程技术研究中心 ,石家庄 050018; 3. 石药集团有限公司 ,石家庄 050041)
摘 要 :建立一种快速 、有效的方法降解青霉素菌渣中青霉素残留 。采用高效液相色谱 ( HPLC)方法检测湿菌渣 , 得到其平均青霉素效价残留为 2 179 U / g,即相对质量分数为 113 mg / g; 将青霉素酶以相对于残留青霉素效价比为 3∶1的比例量混入菌渣中 , 37 ℃, 1 h后可以将残留青霉素完全降解 ,实现了菌渣的无害化处理 ,为青霉素菌渣的资 源化利用奠定了基础 。 关键词 :青霉素酶 ;青霉素菌渣 ;无害化处理 中图分类号 : TQ465. 1 文献标志码 : A 文章编号 : 1672 - 3678 (2009) 05 - 0054 - 04
素钠溶液 ( 5 000 U /mL ) 2 mL混合 ,在 37 ℃恒温水 浴中反应 1 h。反应结束后 ,取 1 mL试样 ,其他步骤 与青霉素标准曲线的步骤一样 ,测 OD 值 A ,根据标 准曲线得出青霉素钠的效价 C。反应前青霉素效价 检测是将酶稀释液换成去离子水 1 mL ,其他步骤与 上述方法一样 ,测 OD 值 B ,根据标准曲线得出青霉 素钠的效价 D。 115 高效液相色谱法 ( HPLC)检测青霉素菌渣中
我国是青霉素生产大国 ,每年有超过 1 万 t的 青霉素干菌渣产生 。其中无毒无害的有效资源占 青霉素干菌渣总质量的 9919% ,可被进一步回收利 用 。因占质量分数仅为 011%的抗生素无法被分 解 ,青霉素干菌渣被禁止循环使用 。目前 ,对菌丝 废渣的处理 ,还在寻求妥善的处置途径 ,部分厂家
pen ic illin un it in the pen ic illin slag
批 次
w (菌渣 ) /
青霉素 (湿 )酶活 /
w (N ) /
%
(U·g- 1 )
%
w ( P) / %
w ( K) / %
1 2 3 4 5 平均
25106 22198 21153 19108 22163 22126
Abstract:A m ethod fo r degrading the penicillin residue in the penicillin p roduction slag was used. HPLC ( H igh Pressure L iquid Chrom atography) m ethod for penicillin content in the waste slag was es2 tablished. The results showed that the penicillin content in the wet slag was 2 179 U / g, or 113 m g / g, by average. The residue penicillin in the slag was comp letely degraded at 37 ℃ for 1 h w ith 3 tim es of p en ic illina se. Key words: penicillinase; penicillin slag; harm less treatment
Applica tion of pen ic illina se in harm less trea tm en t of pen ic illin slag
L IU Hui2juan1 , WAN G L i2li2 , D EN G Kai2shun3 , Y I Hong1
(1. College of B ioscience and B ioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Research Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China; 3. Shijiazhuang Pharmaceutical Group, Shijiazhuang 050041, China)
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