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RESEARCH CENTER FOR DRUG METABOLISM
色谱仪器的组成及原理II
柱温箱
功能:维持流动相与固定相的温度恒定 评价指标: 温度范围 升温或降温的速度 温度
维持的精度 死体积大小
检测系统
紫外 视差检测 质谱检测 电化学检测 荧光检测 DAD检测 蒸发光色散检测等
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梯度洗脱
4500 4000
3500
peak height 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
0 1 2 3 time (min) 4 5 6
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有机相比例对出峰时间和峰面积的影响
3500 3000
peak height
2500 2000 1500 1000 500 0 3500 0 3000 1 2 3 time (min) 4 5 6
peak height
2500 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 time (min) 4 5 6 JILIN UNIVERSITY
FDNB法测定氨基酸含量
主讲教师: 电 话: 电子信箱: 王英武 5619955 wyw@
实验目的
1. 熟悉色谱仪器的组成及原理 2. 了解色谱分离的原理.重点介绍反相色谱柱(以 C18为例) 3. 定量分析的方法(外标法) 4. 梯度洗脱实验及氨基酸衍生化实验(FDNB法)
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定量分析的方法(外标法)
100% Rel. Int. (%)
50%
0% 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.0 Time, min
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定量分析的方法(内标法)
100%
Rel. Int. (%)
50%
0% 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2 2.6 3.0 Time, min
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数据采集系统
软件的可操作性, 采集速率, 文件存储能力 JILIN UNIVERSITY
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色谱分离的原理
色谱分离的基本原理是不同化合物在色谱柱 上的差速迁移导致的色谱分离
分离方式多种多样
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HPLC条件的优化
• 洗脱方式 • 一般采取等梯度洗脱，这样分析速度快 • 但有时也会采取梯度洗脱如分析多肽类化 合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比 等梯度洗脱时强很多，而且可以加大进样 量。是提高灵敏度的一种措施，但是分析 时间较长。需要有平衡的时间。
黄色 白色 红色
Area: 544 High: 85 0.5 mL/min 1.0 mL/min 2.0 mL/min
3.91
Area: 1021 High: 110
7.65 Area: 2028 High: 142
8 9
1
2
3
4
5
6
7
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min
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反 相 Reversed Phase(RP) 2 1 3
3
1
调节剂
2 1
N
调节剂
2 3
流动相方向 极性
流动相方向
H3C C
极性
CH2 CH2
H2C H 2C
CH2 CH2 CH2 CH2
非极性
H2C
非极性 固定相极性较低
H2C
固定相极性较高
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色谱仪器的组成及原理I
HPLC组成Байду номын сангаас
脱气系统(在线与离线) 氦气脱气 真空脱气 超声脱气
流动相传输系统(色谱泵)一元 二元 三元 四元 多元
评价指标:压力限制, 流速范围及精度 冲程大小等
进样系统(手动与自动进样器)
评价指标:精度 重现性 死体积 速度 可控性 (温度及各种其他 功能)
氨基酸衍生化实验(FDNB法)
FDNB法的原理
2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）也叫做 Sanger试剂。DNFB在弱碱性溶液中与氨基酸发生取代反应， 生成黄色化合物二硝基苯基氨基酸（dinitro phenyl amino acid, DNP氨基酸）
分流对紫外检测的影响
1.939 mAU 80 60 40
20
0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 min
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流速对保留时间及峰面积的影响
1.94
mAU 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 0
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HPLC条件的优化
• 柱温对色谱行为的影响 • 依那普利
H3C O O
HOOC
CH3 N
N H
O
COOH
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色谱柱
色谱柱的规格 填料 颗粒粒径孔径 厂商
流动相组成 洗脱方式 柱温 检测方式及具体条件
流动相的组成对分离度的影响
流速对色谱行为的影响 柱温对色谱行为的影响 溶剂对色谱的影响 pH值 离子强度 缓冲液 离子对等其他因素的影响
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正 相 Normal Phase (NP) 3 2 1