・经验交流・体外正常成人肝细胞分离培养的经验Ξ马巧玉,郝　飞,王宇明,宋志强,刘国栋(第三军医大学西南医院全军感染病中心,重庆400038) 摘　要:目的　为进一步研究病毒性肝炎免疫发病机制、临床治疗和疫苗研制提供最接近自然状态的理想细胞模型。

方法　体外二步灌流法分离正常成人肝细胞并用1640培养液维持培养1个月以上。

结果　分离较多量正常成人肝细胞可在体外存活1个月以上。

结论　正常成人肝细胞可在体外被分离培养以供各种肝病基础和临床研究。

关键词:正常成人肝细胞;细胞模型中图分类号:R44611文献标识码:B文章编号:167128348(2003)0921228202 各种肝脏疾病(特别是病毒性肝炎、原发性肝癌)在我国发病率高,无可靠治疗方法。

因此,迫切需要在肝脏疾病的发病机制及治疗方面有所突破。

近年来,国内外有许多关于用动物肝细胞、胎儿肝细胞及肿瘤细胞进行肝脏疾病研究的报道,但这些细胞与自然状态的成人肝细胞存在较大差别。

我们在体外分离培养正常成人肝细胞,以期建立与自然状态最为接近、更适宜于进行肝脏疾病的发病机制和防治等研究的细胞模型。

1　材料与方法111　正常成人肝组织标本,共10例,其中取自意外死亡之3例成年男性(19、24、35岁),1例成年女性(27岁)肝脏;4例成年男性(42、47、55、62岁)胆囊结石或胆囊炎手术时肝脏活检标本;均无肝病史,临床生化和病理检查无异常发现;另有1例成年男性(36岁)肝脏血管瘤标本;2例成年男性(53、58岁)肝癌癌旁组织标本,各种肝炎病毒及AIDS标志物检测均阴性。

112　小牛血清　由本校试剂中心提供,用前56℃×30min灭活补体。

113　主要试剂　(1)PRMI21640细胞培养基:购自美国GIB2 CO公司;(2)胶原酶、胰蛋白酶抑制剂:由美国SIGMA公司提供;(3)分散酶:购自德国宝灵曼公司。

114　实验方法11411　正常成人肝细胞分离　采用体外灌流法分离正常成人肝细胞[1、2]。

取上述成年人肝脏2～100g,将肝组织置于培养皿中,用37℃前灌流液自残存血管中反复灌注,至大部分肝脏呈现灰白色,用37℃,0105%的胶原酶(含011分散酶)反复注入残存血管,剪碎肝组织,37℃振荡,消化30min,三层无菌沙布过滤,450r/min×4min离心,弃上清,加入PRMI21640培养液混匀,450r/min×4min离心,弃上清,反复3次,最后用含10%小牛血清1640培养液(完全培养液)按细胞密度1×106ml 稀释后接种至25ml培养瓶和加爬片的24孔培养板,置于37℃,5%CO2培养箱孵育。

11412　正常成人肝细胞培养　24h后换液,弃去含漂浮细胞的培养液,按上述比例,加入PRMI21640培养液,此后每2～3d 更换完全培养液1次,维持培养1个月以上。

于培养第10、20、30天分别计数肝细胞数,台盼蓝染色确定肝细胞存活率。

2　结 果211　细胞分离　由于肝组织为非全小叶标本,前灌液和胶原酶灌注仅可到达部分肝组织,分离效果较差,加入分散酶后可提高分离效率,分离后用台盼蓝染色显示肝细胞存活率约50%～90%。

212　细胞培养　4例胆囊手术后肝组织分离显示肝细胞少,台盼蓝染色显示肝细胞存活率60%,贴壁差(<50%),碎片多,分离培养1周内均放弃;肝血管瘤标本RBC多,肝细胞相对较少,贴壁差,分离后次日放弃;2例肝癌癌旁组织标本分离肝细胞较多,台盼蓝染色肝细胞存活率仅50%,生长差,贴壁少,细胞碎片迅速增多,于分离后3～4d放弃。

4例意外死亡捐献的肝组织标本,分离细胞后用台盼蓝染色,肝细胞存活率约90%.24h后约70%～80%细胞贴壁,贴壁细胞前呈圆形,后呈多角形,单核,生长良好,加感染血清组与对照组细胞形态无明显差异。

于培养第10、20、30天分别计数肝细胞数台盼蓝染色判断肝细胞存活率,结果见表1。

表1 正常成人肝细胞培养的计数、活力鉴定d肝细胞计数肝细胞存活率10 6.79±0.21×105/ml>90%20 5.56±0.24×105/ml>60%30 4.47±0.32×105/ml>60%3　讨 论目前,在肝脏疾病特别是病毒性肝炎的研究中,用动物肝细胞、肿瘤细胞、人胎肝细胞等作为细胞模型最常见,但这些细胞模型与自然感染状态下的成人肝细胞是否有相似的感染方式、途径及生物学特性尚无定论。

因此,我们建立了正常成人肝细胞分离培养的细胞模型,以期在最接近自然感染状况的情况下进一步研究肝疾病的发病机制、病理改变、临床治疗及疫苗效果。

目前分离肝细胞多采用二步灌流法。

因为我们所取用肝组织为非全小叶标本,灌注时,灌注液不能到达部分肝组织,加之用胶原酶分离正常成人肝细胞效率较分离胎肝细胞、动物肝细胞低,手术中取活检肝组织标本小,分离肝细胞少,难以生长,肝血管瘤组织RBC太多,灌注时不易去除;肝癌癌旁组织均有慢性炎症,纤维化明显,分离培养有较大困难,但意外死亡捐献之肝细胞标本较大,献者年轻,肝脏纤维化程度低,均分离Ξ基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770682)培养成功,在分离成人肝细胞时加入分散酶后可提高分离效率,所用消化酶最好新鲜配制,在最初24h,有部分细胞不贴壁,需弃去。

因此,要求每毫升细胞浓度略高于其它肝细胞培养。

正常成人肝细胞体外培养时间约1个月,有人提出采取胶原凝胶夹层培养和多细胞球状体方式培养[2、3].可提高肝细胞生存效率及延长其存活时间。

近年来,国外有人将兔肝细胞移植到切除90%肝脏、严重肝功能障碍的兔肝或脾上,证实形态完好的移植肝细胞可存活15个月,并能起良好的代偿作用[4]。

目前在治疗各种严重肝病时,肝移植已成为必不可少的方法之一,但供肝严重缺乏,如能将人肝细胞分离后移植在腹膜、脾脏或胰腺上,并发挥其生物作用,在肝病治疗史上将是一个突破性进展。

乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎的发病机制和临床治疗研究一直无突破性进展,这与缺乏适宜的细胞模型有关。

体外培养的正常成人肝细胞可改善乙、丙型病毒性肝炎复制[4～6]。

因此,可用人肝细胞进行下述研究:肝炎病毒怎样吸附于肝细胞,肝细胞上病毒抗原表达与免疫反应的关系,病毒变异、肝细胞感染后病理、功能改变等,人肝细胞还可用于抗病毒药物及疫苗效果判定。

体外分离培养正常成人肝细胞的细胞模型虽然有价格低廉、操作简便,与自然感染状态接近,利于开展关于肝脏病研究的优点,但肝细胞来源有一定困难,细胞培养时间不够长,不能传代等均为此细胞模型的特点,需要进一步研究解决。

参考文献:[1]王宇明,陈国致,董家鸿,等.分离肝细胞的一种体外灌流法[J].中华消化杂志,1994,14:175.[2]K ono Y,Y ang S,Letearte M,et al.Establishment of a hu2man hepatocyte line derived from primary clatter in a colla2 gen gen sandwich culture system[J].Exp Cell Res,1995, 221.478.[3]Li AP,Colburn SM,Beck DJ.A sim plified method for theculturing of primary adult rat and human hepatocytes as muliticellular spheroids[J].In Vitro Cell Der Biol,1992, 28A:673.[4]Moshage H,Y ap SH.Primary cultures of human hepato2cytes:a unigue system for studies in toxicology,virotogy.parasitology and live pathophysiology in man[J].J Hepatol, 1992,15:404.[5]Shimizu YK,Purcell RH,Y oshikura H.Correlation betweenthe effectivity of hepatitis C virus in vivo and its infectivity in vitro[J].Port Natl Acad Sci USA,1993,90:6037.[6]Ito T,Mukaigawa J,Zuo J,et al.Culture of he patitis C virusin primary hepatocyte culture from patients with chronic hepatitis C results in release of high titre infecious virus[J].J G en Viro,1996,77:1042.・经验交流・专业转运新生儿临床分析华子瑜1,叶荣民2,徐天鹤1,余加林1,漆正常1,李世红1,陈贻骥1,邓　春1,包　蕾1,王家蓉1(11重庆医科大学附属儿童医院新生儿科　400014;21重庆市长寿区人民医院儿科　401200) 摘　要:目的　分析专业新生儿急救转运(N ETS)的运作特点及临床意义,确保N ETS运作安全性的提高。

方法　用回顾性统计学分析方法,分析我院N ETS转运的215例新生儿的临床特点,总结院前急救经验。

结果　我院N ETS已具有较强的专业人员及完善的设备配置,与重庆地区及周边区域43家基层医院建立稳定的转运协作关系,院前急救、途中监护等N ETS运作规范有效,确保转运新生儿的安全;危重儿约95.6%,转运前常伴发低体温、酸中毒、低血糖,经现场急救稳定病情后,215例均安全转运回院。

转运患儿中,肺炎、缺氧缺血性脑病、早产儿为常见疾病,发生率分别为81.9%、69.8%、64.2%;早产儿胎龄多小于35周117/138(84.8%),双胎或多胎占27.5%;,治愈好转率88.4%。

结论　规范化的N ETS应包括专业人员组队、及时有效的院前急救、途中严密监护病情,可最大限度地保障危重新生儿安全的转运,为后续治疗争取了宝贵时间,对减少后遗症发生有积极作用。

关键词:新生儿;急救转运;院前急救中图分类号:R7201597文献标识码:B文章编号:167128348(2003)09201229203 20世纪70年代初国外建立了新生儿急救监护中心(N ICU),不久建立新生儿急救转运系统(N ETS),开展危重新生儿转运工作;随着N ETS的完善与普及,高危儿得到及时的产房抢救和院前监护、诊疗,使新生儿病死率及致残率明显降低。