MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验
1.实验步骤：
1.1.调整淋巴细胞浓度：
a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min；
b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将
脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研
钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料
离心管；
c)离心1500rpm, 5min；
d)用Hank’s液洗2次；
e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀
后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡；
f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。

（假定4个大方格内总数为N，则
该细胞悬液的浓度为n=105*N）
1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。

以
100μl/孔加入96孔细胞培养板中。

（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。

）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。

不同品种的动物也有一定的不同。

1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防
止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。

细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。

1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。

每过24小时需取
出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。

1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。

1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去
细胞培养液，纸巾吸干。

加入DMSO，150ul/孔。

充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解）
1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。

2.实验仪器和材料：
2.1超净工作台（用前紫外灯照15-25min），酒精灯，酒精棉球；
2.2烧杯（250ml，用来盛放小鼠），酒精75%，2个
2.3培养液瓶（100ml），5个
2.410ml移液管或小量筒（50 ml），2个
2.51640培养液，胎牛血清，庆大霉素；
2.6小平皿（若干），剪刀，镊子，
2.7Hank’s液，1ml注射器，200目铜网；
2.810ml塑料离心管，离心机，胶头滴管；血球计数器，盖玻片，冰醋酸染液，
显微镜；
2.9刺激物Con-A、PHA（T细胞）和LPS（B细胞）；
2.1096孔培养板；50ul，200ul，1ml吸头和相应量程的可调移液器；
2.11CO2培养箱，倒置显微镜；
2.12MTT，0.22微孔滤器；离心机（可用于96孔板离心），异丙醇，盐酸，酶
标仪。

3.试剂配备
3.1培养液在1640培养液中加入10%小牛血清、庆大霉素（终浓度30ug/ml）。

（小牛血清融化后，离心1500rpm, 5min，以便除去热灭活后形成的沉淀）培养液配好后，放4℃保存（拧紧瓶盖，否则CO2逸出，PH升高，颜色变紫）。

3.21.5%冰醋酸
4.2ml 36%冰醋酸，加入9
5.8ml超纯水，放于4℃保存。

3.3MTT 用培养液稀释至2mg/ml，充分溶解后，过0.22微孔滤膜。

3.4酸性异丙醇96ml异丙醇,加入4ml 1M盐酸。

(1M盐酸称1g 36-38%盐酸
（0.1ml）,加生理盐水至10ml)。