1 2 3
9
10
可重复滤过
超净台下操作全过程 4
5
8 6
7
实验步骤
（二）制备单个核细胞悬液：
塑料漏皿
1. 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套 中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中， 加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。 弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离 心5min；
实验步骤
（一）取小鼠脾脏（3人1组） • 小鼠颈椎脱位处死
用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍 向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
• 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪 及筋膜组织。
取脾脏
1
2
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8
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可重复滤过
10
（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
实验步骤
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.计算细胞总数：
细胞总数=平均每个大方格中细胞数（4个大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数。
计数时需要遵循一定的方向逐格进行以免重复或遗漏，对压线细 胞采用数左不数右，数上不数下的原则。
3.清洗：加500ulPBS,吹打混匀后， 5000rpm， 4℃，5min
4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul 混PBS吹打匀，置于冰上， 流式细胞仪检测
设定对照（代表）
CD3： T cell CD4+ T cell； CD8+ T cell
1. No stain 2. 单染CD3 3. 单染CD4 4. 单染CD8
陷人麻醉状态，3～5min死亡。 ❖ 5．注射麻醉法：应用戊巴比妥钠注射麻醉致死。 ❖ 6 ．吸入二氧化碳：此法安全、人道、迅速，被认为是处理啮齿类的理想方
法，国外现多采用此法。可将多只动物同时置入一个大箱或塑料袋内，然后 充入CO2，动物在充满CO2的容器内l～3min内死去。
实验二报告分析
实验结果的呈现方式：结合图进行文字描述
预实验结果
Control
50ul PBS+ 0.5ul Ab
50ul PBS+ 2ul Ab
APC-CD3 T cells
PE-CD19 B cells 分析数据时建议只放一组实验组，各人可自行安排
实验小鼠处死方法
❖ 1．颈椎脱臼法：是大、小鼠最常用的处死方法。用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱日，造成脊髓 与脑髓断离，动物立即死亡。
❖ 2．空气栓塞法：主要用于大动物的处死，用注射器将空气急速注入静脉，可 使动物致死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液相 混致血液呈泡沫状，随血液循环到全身。如进入肺动脉，可阻塞其分支，进 入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快 致死。
❖ 3．急性大失血法：用粗针头一次采取大量心脏血液，可使动物致死。 ❖ 4．吸入麻醉致死法：应用乙醚吸入麻醉的方法处死。大、小鼠在20～30秒
实验讨论：1. 根据结果的描述，进行归纳总结， 3. 实验影响因素探析 4. 实验误差原因分析 5. 进行合理化的建议
阴性实验结果的原因分析 1. 指出最可能的原因 2. 思考补救措施
抗原和抗体反放是否会出现结果？
弧形沉淀及沉淀倾斜的原因分析？
2. 在用ACK破坏红细胞时，不要时间过长，以免破坏其他 细胞。
（五）流式细胞术染色
事先准备好
1.收集细胞：取细胞总数约1x106-5x106脾脏细胞于1.5ml EP 管中（在 管盖上标记好组别），1500rpm， 4℃，5min（离心机需预冷）
2.染色：小心用枪吸去上清，再加入50ul预混抗体的PBS（ CD3抗体 100倍稀释； CD4抗体200倍稀释； CD8抗体500倍稀释），将细胞吹 打混匀，避光，4℃15-20min
实验四：小鼠脾脏单个核 细胞的分离
实验五：流式细胞术 检测淋巴细胞表面标记
邵红霞
舒望琴
熟悉细胞分离的基本原理 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法
解剖图
胸腺位于胸腔胸骨后、纵隔前 上方，覆盖在心脏前上方的白 色组织。通常小鼠鼠龄越小， 胸腺体积相对越大。
小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体 积较大，长条形态，属于外周免 疫器官。外周血中淋巴细胞可经 再循环注入脾脏等外周免疫器官 的特定区域，所以富含各类免疫 细胞。
细胞总数和细胞活力可以一起做
活细胞
细胞总数=视野内活细胞数+死细胞数
细胞活力=活细胞数/总数x100%
死细胞
自动化细胞计数器Luna™ 韩国Logos Biosystems公司
一块计数板/2组
在5×104 – 1×107 细胞/ml的浓度范围 3-60 µm的细胞直径范围内
注意事项
1. 通常分离细胞是为了下一步实验。有些实验如需要对细胞 作进一步培养，则在分离细胞时一定要严格无菌操作。
3. 弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为 小鼠脾脏单个核细胞悬液。
4. 取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）
5. 以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度
注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力
每只小鼠脾脏细胞一般为1x107-2x108