中华医学检验杂志CHINESE JOURNAL OF MEDICAL LABORATORYSCIENCES1998年 第6期 No.6　November 科技期刊酶偶联法测定血清血管紧张素转换酶金化民　张茨　陈葳　陈谦 【摘要】　目的　建立一种测定血管紧张素转换酶(ACE)的酶偶联法。

方法　血清与底物马尿酸双甘肽(Hip-Gly-Gly)混合温育30分钟，生成马尿酸(Hip)与双甘肽(Gly-Gly)，再加入L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN)和γ-谷氨酰基转移酶(GGT)，催化GGCN与Gly-Gly偶联，产生的3-羧基-4-硝基苯胺于410 nm波长测定其吸收度。

结果　当底物pH8.0，GGCN1.0 mmol/L，GGT 6.7 kU/L时，ACE活性与吸收度值有良好线性。

55份健康人血清ACE(±s)289±83 U/L，CV：批内4.6%；批间4.8%。

10份肉样瘤患者血清ACE(±s)748±34.9 U/L，批内CV3.9%，回收率96%～103%。

结论　酶偶联法测定ACE活性具有操作简便、迅速、重复性好，适用于手工操作或自动化分析，可用于诊断早期肺损伤和人类免疫缺陷病毒感染。

【关键词】　酶偶联法 γ-谷氨酰基转移酶 血管紧张素转换酶 活性Determination of serum angiotensin-converting enzyme by enzyme coupling spectrophotometry Jin huamin Zhang Ci, Chen Wei, et al. First Affiliated Hospital ， Hubei Medical University, Wuhan 430060 【Abstract 】　Objective To establish a new method to measure ACE activity using the coupled reaction which is catalyzed by γ-glutamyl-transferase (GGT). Methods GGT was added as catalyts after the mixture of serum and substrate hippurylglycyl-glycine had been incubated for 30 minutes at 37℃, it participated from as receptor substratefor a γ-glutamyl group transfered from a donor substrate, L-γ-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide was measured at 410 nm. Results The ACE activity and absorptance was linearly related when pH was 8.0, GGCN was 1.0 mmol/L, and GGT was 6.7 U/L. The mean value (±s) of serum ACE in 55 normal and 10 sarcoid specimens was 289±83 U/L, and 748±34.9 U/L respectively, and the within-run and between-run CV was 4.6% and 4.8% respectively. The later within-run CV was 3.9%, and the recovery rate was 96%～103%. Conclusion ECS is a simple, quick, and reliable method, and it can be used for early detection of the infection of HIV and the damage of the lung. 【Key words 】　Enzyme coupling spectrophotometry Gamma-glutamyltranspeptidase Angiotensin-converting enzyme Activity 血管紧张素转换酶(Angiotensin-Converting Enzyme, ACE∶EC为3.4∶15.1)，又名激肽酶Ⅱ，按系统命名法为肽酰二肽水解酶，属于羧基外肽酶。

它的生理功能是催化血管紧张素Ⅰ(ATⅠ)水解成为血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)，释放出组-亮二肽；也可水解缓激肽，释放出苯丙-精二肽。

ACE是一种血管内膜细胞核膜糖蛋白，在体内分布很广，几乎遍布人体各个脏器，归纳起来分为血管内和血管外两类。

血管内ACE主要分布在肺血管床；血管外ACE主要分布在肾近曲小管和小肠绒毛的刷状缘。

在某些疾病，一些由单核细胞分化而来的细胞可产生大量的ACE并释放入血，引起血清ACE活性升高，在临床上具有诊断意义。

国外已将ACE测定列为结节病上皮样肉芽肿，高雪病的诊断和预后估计的常规项目［1］。

血清ACE活性变化在诊断急性肺损伤及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染方面已受到极大重视。

相继建立了荧光光度法、放射性同位素法、高效液相色谱法和分光光度法。

这些方法都是基于ACE水解基质马尿酸-组氨酰-亮氨酸或马尿酸双甘肽(Hip-Gly-Gly)，产生马尿酸(Hip)和组氨酰亮氨酸或双甘肽(Gly-Gly)，然而这些方法有的要用有机溶剂提取［2］，有的需要衍化或去除血清蛋白，还有的需要特殊设备或接触放射性试剂［3］，因而推广应用受到限制。

近年来，Groff等［4］报告一种由γ-谷氨酰基转移酶(GGT)作指示酶的酶偶联法测定血清ACE，认为是目前测定ACE的理想方法。

该法操作简单，重复性好，既可用于手工操作，又可用于自动化分析。

我们根据国内条件作了一些改进和探讨，报告如下。

材料与方法 一、试剂 1.HEPES缓冲液(50 mmol/L)：取HEPES(Sigma产品)1.191 g加双蒸水100 ml溶解，用于配制GGT、GGCN和基质缓冲液。

2.GGT贮存液(20 kU/L)：取HEPES缓冲液5 ml加入GGT(批号Lot 112H9620)100 U，混匀后分装小瓶-20℃存放。

3.GGT应用液(6.7 kU/L)：将上述贮存液用二倍量的HEPES稀释配制。

4.GGCN(1.0 mmol/L)：取L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN，Sigma产品，批号Lot73HO7290)20 mg加入50 mmol/L HEPES 60 ml，混匀溶解后4℃保存。

5.基质缓冲液：HEPES 1.191 g，NaCl 1.755 g，Na2SO4 5.68 g用双蒸水溶解后，以NaOH调pH到8.0，再补充双蒸水到100 ml，置4℃备用。

6.基质液：由Hip-Gly-Gly(Sigma产品，批号Lot 88F5805)89.5 mg加基质缓冲液10 ml溶解混合而成。

此液各试剂终浓度为HEPES 50 mmol/L，NaCl 30 mmol/L，Na2SO4 400 mmol/L，Hip-Gly-Gly 30 mmol/L。

7.双甘肽标准液(10 mmol/L)：称取甘氨酰甘氨酸(Gly-Gly, Sigma产品)52.9 mg加双蒸水溶解，定溶至100 ml。

此液双甘肽浓度为40 mmol/L，应用液由1份贮存液和3份双蒸水混合而成。

二、测定方法 1.原理：血清中的ACE作用于底物马尿酸双甘肽，生成马尿酸和双甘肽，再由加入的GGT催化L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN)与双甘肽偶联，生成3-羧基-4-硝基苯胺，在410 nm处测定其吸光度，ACE活性与生成物量呈正比。

偶联反应如下：马尿酸双甘肽ACE马尿酸+双甘肽双甘肽+GGCNGGTγ-谷氨酰双甘肽+3-羧基-4-硝基苯胺 2.测定方法：取4只小试管，分别标明测定管(T)、标准管(S)、血清空白管(SB)、试剂空白管(RB)。

按附表操作。

附表　测定操作步骤加入物加入量(μl)T S SB RB血清　10-　10-ACE基质液100---基质缓冲液-100100100HEPES液---　10双甘肽标准液-10--混合，37℃30分钟GGCN(1.0 mmol/L)850850850850混合，37℃ 10分钟GGT应用液50505050 以双蒸水调零点，410 nm比色，记录各管2分钟吸收度ΔA，按下式计算： 单位定义：血清与底物在37℃条件下每升血清每分钟释放1 μmol/L双甘肽所需要的酶量为一个ACE单位。

结果 1.GGCN浓度选择：本反应体系中GGCN既是测定酶ACE的受体，又是指示酶GGT的供体。

我们比较了0.5、1.0、1.5 mmol/L的GGCN与吸光度A的关系(图1)。

结果以1.0 mmol/L的GGCN最理想，在此浓度下GGCN与吸光度保持良好线性。

图1　GGCN浓度选择 2.GGT对测定的影响：本反应利用GGT将双甘肽与GGCN偶联，生成黄色的3-羧基-4-硝基苯胺，GGT加入量对测定有一定的影响，高GGT浓度会导致底物过度消耗，吸光度偏离线性，低浓度GGT又使吸光度偏低，灵敏度不高(图2)。

我们采用每次加入0.335UGGT，能获得理想吸光度与线性，在此浓度下，酶基质液的空白吸光度＜0.1A。

图2　GGT浓度对测定的影响 3.线性：取不同量10 mmol/L双甘肽标准液按操作方法测定，记录2分钟的ΔA，图3表示反应速率与双甘肽含量之间的关系，表明当ACE在1 500 U/L以下时，本法具有良好线性，即使高ACE活性的样本，不用稀释也可获得理想的结果。

图3　双甘肽与吸收度的线性关系 4.精密度试验：我们测定了10份正常人和10份肉样瘤患者血清ACE活性，每份标本平行测定3次，取均值。

批内正常人(±s)308±16.8 U/L，CV4.6%；肉样瘤(±s)748±34.9 U/L，CV3.9%；批间CV是用一份正常人血清每日测定一次，连续10天来计算，结果(±s)323±20.4 U/L，CV4.8%。

5.回收试验：采用ACE活性302 U/L和627 U/L各一份血清分别加入10 mmol/L双甘肽标准液，重复测定3次，回收率96%～103%。