通过本次实验, 通过本次实验,学习和掌握小鼠骨髓 多染红细胞(PCE)微核的测定方法 的测定方法， 多染红细胞(PCE)微核的测定方法，了解 环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。 环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。
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6. 注意事项
1.良好的骨髓涂片及良好的染色， 1.良好的骨髓涂片及良好的染色，是本实 良好的骨髓涂片及良好的染色 验的关键步骤。 验的关键步骤。 2.熟悉并正确区分跟中骨髓细胞 熟悉并正确区分跟中骨髓细胞。 2.熟悉并正确区分跟中骨髓细胞。
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4. 实验步骤
与沉淀物混匀后， 与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在清洁的 载玻片上推片。 载玻片上推片。阳性及阴性对照组按上述方法同 时进行处理。 时进行处理。
三、固定
将推好晾干的骨髓片放人染色缸中， 将推好晾干的骨髓片放人染色缸中，用甲醇溶 液固定15min 取出晾干。 15min， 液固定15min，取出晾干。不能及时染色的涂片 也应固定后保存。 也应固定后保存。
2. 实验原理
微核试验是用于染色体损伤和干扰细 微核试验是用于染色体损伤和干扰细 胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。 胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。 微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗 微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗 大小相当于细胞直径的1/20 1/5， 1/20～ 粒，大小相当于细胞直径的1/20～1/5， 呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致， 呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致， 在间期细胞中可以出现一个或多个。一般 在间期细胞中可以出现一个或多个。 认为微核是细胞内染色体断裂 细胞内染色体断裂或 认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受 影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核 影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核 外的遗传物质 遗传物质。 外的遗传物质。
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5. 结果分析
本试验中只计数PCE中的微核，微核率以千分 本试验中只计数PCE中的微核， PCE中的微核 率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、 率表示。每只动物为一观察单位。每组的雌、雄 动物分别计算微核PCE的均值。 PCE的均值 动物分别计算微核PCE的均值。雌、雄动物之间 无明显的性别差异时可合并计算结果， 无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分 别进行计算；正常的PCE NCE比值约为1(正常范 PCE／ 比值约为1( 别进行计算；正常的PCE／NCE比值约为1(正常范 围为0.6 1.2)。如比值<0.1 则表示PCE 0.6～ <0.1， PCE形成 围为0.6～1.2)。如比值<0.1，则表示PCE形成 受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大， 受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验 结果不可靠。 结果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发 生率， 生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道 结果或者是与研究的历史数据相一致。 结果或者是与研究的历史数据相一致。
食品专业
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系：生化环院
任课老师： 任课老师：吴雨龙 任课班级：09食品、 09食品 任课班级：09食品、行09食品 食品
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1. 实验目的
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4. 实验步骤
二、骨髓液的制备和涂片
试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈 试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈 椎脱臼或麻醉的方法将其处死， 的方法将其处死 椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖 将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨， 板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨， 擦净血污，剔去肌肉，剪去股骨两端， 擦净血污，剔去肌肉，剪去股骨两端，用小型弯 止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片 将骨髓挤于 止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片 上，混合均匀后推片。也可在动物处死后，迅速 混合均匀后推片。也可在动物处死后， 用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉， 用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理 盐水洗去血污和碎肉，剪去股骨两端， 盐水洗去血污和碎肉，剪去股骨两端，用带针头 2ml注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔内， 注射器吸取小牛血清 的2ml注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔内，将骨 髓冲人离心管， 髓冲人离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均 1000r／min离心10min，弃去多余的上清液， 离心10min 匀，以1000r／min离心10min，弃去多余的上清液， 留下约0.5ml 留下约0.5ml
四、染色
将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa应 将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa应 Giemsa 用液(Giemsa储备液l份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9 (Giemsa储备液 pH6.8的磷酸盐缓冲液 用液(Giemsa储备液l份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9 染色10 15min，然后冲洗掉玻片上的染色液， 10份)染色10-15min，然后冲洗掉玻片上的染色液， 置晾片架上晾干。 置晾片架上晾干。
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4. 实验步骤
五、观察计数
先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀， 先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色 低倍镜下进行观察 较好的区域，再在油镜下观察计数，PCE细胞呈 油镜下观察计数 较好的区域，再在油镜下观察计数，PCE细胞呈 灰蓝色，正染红细胞(NCE)呈橘黄色。 (NCE)呈橘黄色 灰蓝色，正染红细胞(NCE)呈橘黄色。细胞中含 有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐， 有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与 核质一致，呈紫红色或蓝紫色。 核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出 现一个或多个微核。计数1000 PCE中含微核的 1000个 现一个或多个微核。计数1000个PCE中含微核的 PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。 PCE数 并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。 200个细胞中PCE 的比值
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2. 实验原理
所以， 所以，微核试验能检测化学毒物或物理因 素诱导产生的染色体完整性改变 染色体完整性改变和 素诱导产生的染色体完整性改变和染色体 分离改变这两种遗传学终点 这两种遗传学终点。 分离改变这两种遗传学终点。 微核可以出现在多种细胞 多种细胞中 微核可以出现在多种细胞中，但在有 核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物 相区别。由于红细胞在成熟之前最后一次 相区别。由于红细胞在成熟之前最后一次 红细胞 分离后数小时可将主核排出 而仍保留微 主核排出， 分离后数小时可将主核排出，而仍保留微 核于PCE细胞中 因此通常计数PCE细胞 PCE细胞 计数PCE细胞中 核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中 的微核。 的微核。
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3. 实验材料
实验动物： 实验动物：
体重18-22g小鼠，雌雄对半。 体重18-22g小鼠，雌雄对半。 18 小鼠
实验器材： 实验器材：
手术剪、晾片架、眼科剪、眼科镊、 手术剪、晾片架、眼科剪、眼科镊、 显微镜、饲养笼等。 显微镜、饲养笼等。
实验试剂： 实验试剂：
甲醇、冰醋酸、吉姆萨染液、 甲醇、冰醋酸、吉姆萨染液、小牛 血清、生理盐水、环磷酰胺。 血清、生理盐水、环磷酰胺。
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4. 实验步骤
一、试验动物及处理
1.动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。 1.动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。 动物选择 以小鼠使用最为广泛，要求体重18 20g， 18～ 以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7-12 周龄。每组小鼠数量10 10只 雌雄各半。 周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。 2.染毒途径 染毒途径： 2.染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性 质的不同，可分别选用经口、经皮、 质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道 及注射等染毒途径。 及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与 人体接触化学毒物相同的途径。 人体接触化学毒物相同的途径。 3.染毒次数及取样时间 染毒次数及取样时间： 3.染毒次数及取样时间：研究证实化学毒物需 在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作 用。不同化学毒物诱发微核出现的高峰时间也 不尽相同。波动范围可以达到24 72h。 24～ 不尽相同。波动范围可以达到24～72h。这就要