卢先雷
1
概论
学习本课件我们主要掌握和了解的内容：
* 什么是细菌系统鉴定？ * 细菌系统鉴定与细菌系统分类学 * 细菌系统鉴定手段（方法学） * 细菌系统鉴定流程与鉴定试验的基本组合 * 鉴定试验的质量控制 * 小结与练习
2
细菌系统鉴定的定义
* 以细菌系统分类学为原则，根据细菌某些 生物学性状的差异，挑选一些具有较高鉴 别作用的试验，经过精简与优化组合，用 以测定未知细菌，得出试验结果，再与已 知细菌数据库进行比较，从而推断未知细 菌在分类体系中位置的方法。
4
细菌系统分类学的经典书籍
* BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology（《伯杰氏系统细菌学手册》） 是研究细菌系统分类学的全球经典书籍
5
6
细菌分类单元
−域
−界
−门
−纲

7
细菌系统分类法
* 传统分类法
* 林奈分类原理：偏重原理
* 数值分类法
* 目前技术能培养的细菌采用传统手段 * 难培养细菌采用分子生物学手段（如麻风分支杆菌、
肺炎支原体、肺炎衣原体等） * 而传统手段难以进一步鉴定的细菌则采用抗原抗体
血清学分类（如军团菌、沙门菌、志贺菌等）、细 胞壁脂肪酸结构和组成分类（如棒状杆菌相关属）、 挥发性代谢产物（如厌氧菌挥发性脂肪酸）指纹分 析 * 其他：如细胞壁蛋白电泳分类、细胞壁多糖分子与 肽聚糖结构分类等
22
酶速率法
* 梅里埃VITEK2 compact
* 可见光色源酶底物如对硝基苯胺（金黄色）作为 呈色基团
* BD Phoenix 100快速卡
* 荧光色源酶底物如荧光香豆素、4-甲基-7-羟基-香 豆素衍生物，可见光色源如对硝基苯胺（金黄色） 作为呈色基团
原理：底物-色源复合物(无色) 待检酶 游离色源 水解底物
* 细菌鉴定是细菌分类学的一种实践应用， 要掌握细菌鉴定，必须掌握系统分类学。
3
细菌系统分类学
* 细菌系统分类学是为研究目前已知细菌在 亲缘关系上远近程度而建立起来的一整套 分类方案。
* 使用该方案我们不仅可以了解一株未知分 离菌在已知分类单元中的最佳匹配位置， 还可以快速而准确的发现新种，并将之归 入对应的位置。
25
26
MALDI-TOF指纹图谱
27
细菌鉴定试验、流程 与鉴定试验的基本组合
* 鉴定试验 * 试验流程 * 试验的选择与组合
28
鉴定试验
* 形态学观察 * 生化反应试验 * 血清学试验 * 分型试验
* 血清学分型 * 噬菌体分型（不常用） * 细菌素分型（不常用）
* 动物试验（普通临床实验室不用）
9
细菌之间亲缘关系表示方法
* 相似系数矩阵图（数值分类法） * 树状拓扑学（综合分类法）
* 系统发育树 * 放射树 * 基础树
* 生物群落图（新的表示方法，尚未一致认 可）
10
相似系数矩阵图
11
树状拓扑学
12
细菌鉴定手段（方法学）
* 细菌鉴定的基本思想方法基于分类学 * 所采用的鉴定试验取自于分类学，根据被
* 可见光色源酶底物——梅里埃V2C * 荧光色源酶底物——BD Phoenix 100快速卡
16
数字编码鉴定法原理
1、形成数据库
17
2、将试验结果转化为反应数值
18
3、分别计算每个分类单元出现所测 定反应谱型的概率
19
4、计算鉴定符合百分率（id%）与模 式频率（T值）
20
5、根据id%、相邻id%比值、T值进行 降序排序
研究对象群体的不同，挑选和优化组合， 选择出适合于临床实验室操作的鉴别能力 强、可行性高的试验用于鉴定 * 根据试验的选择组合与这些试验操作时具 体的指导思想方法、应用流程，以及借助 工具的不同将细菌鉴定方法分成了几个不 同阶段
13
不同种群的细菌根据培养的难易以及实际操作 时的难度而采用不同的鉴定手段
23
酶速率法原理
OD cutoff
α
t
V=Δy/Δx=tanα V＞cutoff = “+” V＜cutoff = “-”
24
MALDI-TOF 基质辅助激光解吸电离飞行时间
* 原理：检测来自完整细菌的蛋白质构成。 先将待测样本与基质混合，均匀涂布在样 品板上，放入MS仪器。基质吸收来自激 光的能量，与样本一起蒸发，与此同时将 样本电离。带电样本通过电场进入飞行时 间检测器，离子依质荷比不同而分离，最 终可以在飞行管的末端检测到每个离子的 丰度。 通过查阅比对内置指纹图谱数据库即可 得出鉴定结果
29
形态学观察
镜下形态学观察：
• 不染色标本
• 染色后镜下形态
– 暗视野动力观察
– Gram染色
– 念珠菌孢子和菌丝的 观察
– 丝状真菌小培养动态 观察
– L型菌落与特殊细菌 菌落解剖结构
– 抗酸染色 – 异染颗粒染色 – 荧光染料染色 – 荧光抗体染色 – 乳酸酚棉兰染色 – 墨汁染色
30
形态学观察
14
细菌鉴定方法学分类
* 传统手段——表型鉴定 * 分子生物学手段——基因型鉴定 * 抗原抗体、细胞壁成分、代谢产物指纹等
手段——分子鉴定
15
细菌表型鉴定方法学
* 表型鉴定方法学分类与历程： * 传统林奈双岐图表法
* 双歧索引法 * 表解法
* 数字编码鉴定法
* 手工查表 * 仪器鉴定
* 酶速率法
* 100~200项生理生化特征相似度（百分率）： 等重原理
* 综合分类法
* 生理生化、遗传物质、化学分子比较等手段 综合应用
8
细菌系统分类学手段
* 表型特征分类 * 形态学分类 * 生物化学代谢途径分类 * 噬菌体生物学分类
* 遗传特征分类 * DNA结构分类 * RNA结构分类
* 分子结构分类 * 抗原抗体血清学分类 * 细胞壁多糖分子与肽聚糖结构分类 * 细胞壁脂肪酸结构和组成分类 * 细胞壁蛋白电泳分类
21
6、结果评价
1、仪器只显示唯一结果，说明结果该鉴定能到到种的水平 2、如果提示两个以上结果，但都是同一个属的细菌。则说明该鉴 定只能达到属的水平 3、如果鉴定id%＜80%，则结果不可靠 4、如果仪器提示结果不可接受，则说明 1）试条/卡选择错误 2）分离菌不适合采用该方法 3）菌不纯，特别是显示出大于两项生化反应结果不符合时。
菌落形态观察：
* 大小（细如针尖、小、中等、大） * 质地（坚硬、干燥、湿润、水滴状） * 光滑程度（粗糙、光滑、粘液型） * 凹凸（扁平、微凸、凸起、中性凹陷） * 颜色（白色、灰色、黄色、绿色、红色、黑色等） * 透明程度（透明、半透明、不透明） * 边缘（整齐、星状、有伪足、枫叶状、树叶状等） * 溶血性（α、β、γ） * 其他、琼脂凹陷、气生菌丝、菌落背面颜色、菌落