基因的构建程序②基因组DNA的制备
为了最大限度保证度的断裂。制备的
DNA分子规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 构建流程
随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机 碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的 起点。 由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合 位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特 长的 mRNA 分子的 5‘端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文 库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5' 末端，如 RTPCR 和物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA
种类不同（即基因
① 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； ② 第一链 cDNA 合成； ③ 第二链 cDNA 合成； ④ 双链 cDNA 克隆





Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA双链和载体的连接 转化或转染 快速鉴定 pBlueScript cDNA库扩增
5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ T4-DNA ligase AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5’ 3’
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’
A A A A
白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 >100 kb大小的DNA片段基因的构建程序③基因组DNA的切割
用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区
第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头
方法一：粘末端连在基因组的构建过程中，最好选择转化效率高的
进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！基因组的构建程序基因的构建程序
基因组构建的技术性问题在基因组的构建过程中，最应引起重视的问题是：
严禁外源DNA片段之间的连接！！！基因组的构建流程 cDNA的构建流程
基因的构建程序基因组的构建流程 ① 载体的选择和制备； ② 高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取； ③ 基因组 DNA 的部分酶切与分级分离； ④ 载体与DNA片段的连接； ⑤ 转化或侵染宿主细胞。基因的构建程序①载体和受体的选择
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组构建的载体通常选装载量较大的 l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 由于绝大多数真核生物的几种载体的最大装载量如下： 质粒 l-DNA 考斯质粒 BAC YAC 15 kb 25 kb 45 kb 300 kb 400 kb
3‘ HO
G 5‘ppp’5 G
3‘ HOCCCCCCC 3‘ HOCCCCCCC
退火
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG TTTTC 5‘ pGGGGGGG
TTTTTp 5’ AAAAAOH 3’
cDrary） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存无需mRNA的纯化，不 仅简化操作，而且避免了低丰度DNA克隆。此法对植物基因功能的研究，如对 某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研 究尤为适用。
部分酶切法一般选用4 碱基识别序列的限制性内切酶，如：
Sau3A或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级
分离，以杜绝不相干的宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重和插入DNA片段连接过程中有两个重要 参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和 纯度。大约10pgλ噬菌臂和4μgDNA能产生有效地包装06。 5、包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多。而在70℃中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装 抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如 Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量 高，且在体外包装λ噬菌体DNA和插入片 一、 RNA 的分离 mRNA 的完整性 mRNA 的丰度 （丰度高用质粒，丰度 低 二、cDNA 第一链的合成 反转录酶：AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒）和 MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒） 引物： Oligo（dT）和随机引物
OH
5’
3’
Klenow
dNTPs TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
S1 TTTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAAAA
cDNA第二链的合成
置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 5‘ppp’5 G G
RNaseH AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp DNApol dNTPs AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ 5’
四、双链 cDNA 连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖
同聚物加尾法、人工接头法基因组和cDNA的比较基因组
信息供体 载体 连接前 连接 筛选 DNA 噬菌体，黏粒，人工染色体 部分酶切，分级分离 粘端成cDNA双链 同聚物加尾，库：表达载体（自身引导法 置换合成法 引导合成法
cDNA第二链的合成
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失
G 5‘ppp’5 G
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp NaOH 煮沸 5’
TTTTTTTTTTTTTTp
双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：
平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头构建流程
Oligo（dT）引导的 cDNA 合成是指 Oligo（dT）引 物与 mRNA 3' 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 NA 末端存在较长的 poly（A） 成cDNA双链 同聚物加尾，所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )
其中/ 生物基因组的大小 例如，人的单倍体D的构建流程
组织
mRNA
cDNA 载体
DNA
部分酶解 DNA DNA长度分级 可克隆之DNA DNA与载体连接 引入宿主细胞
双链cDNA筛选出所需 要的克隆鉴定的完备性扩增后供长 期储存
基因组和cDNA的比较基因组信息供体 载体 连接前 连接 筛选 DNA 噬菌体，黏粒，人工染色体 部分酶切，分级分离 粘端连接，人工接头 核酸探针
为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：
将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 在的关键。基 因组DNA应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够 大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。 2、不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染少 量探针顺序或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过 程中它们将被鉴定为所要的克隆。 3、部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱基 的限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所 产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先 检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有效 地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和DNA浓度及纯度。