重 组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。
cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,组中分离单拷贝的基因；N
AAAAAAA mRNA
(b)寡聚(dT)引物
第一条 cDNA 的合成
An
An
Tn
(c)发夹引物
第二条 cDNA 的合成
TTTTTTຫໍສະໝຸດ GGGGGGCCCCCC
加接头 1
TTTTTT
GGGGGG
AAAAAA
CCCCCC
(d)同聚物加尾反应 TTTTTT
TTTTTT AAAAAA
连接 DNA 片段和载体
重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化)
基因库的鉴定与段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或差A。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
高速搅拌：1500转/分×30分 长度8kb的分子群体。
可切 平均
3.双酶消化
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考 虑到载体容量，如噬菌体插入片段不超过 25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平 均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平 均长度4096 bp.
双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb, 但如采用双酶部分消化，产物的分子量 可达10～30kb,它们存在着随机序重叠， 用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片 段群体按大小分开，可得到的分子量大 小约为20kb的随机DNA片段群体。
一般为99％； I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb; G: 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp
将数据代入上式
N ln(1 0.99) ln(1 17kb / 30Mb)
= 8.1×105 N的含义是克隆大小为1799％的RNA和tRNA因其丰 富和大小的一致性，可以通过分级直接分离)。 mRNA的提取可以通过多胸腺嘧啶的柱子分离。 然后被反转录。cDNA第一链的合成用oligo(dT) 引物，因为长的mRNA没有被完全反转录,因此 中部可加另一引物。第二链cDNA的合成是用 自身引物的，一个更有效的方法是在cDNA第 一链加尾(如多聚胞嘧啶)，然后用oligo(G)为 引物起始第二链的合成。这样产生的双链 cDNA可以通过加接头或同聚尾巴插入载体。
存在的问题：
①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，
基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。
②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，完整筛出更不容易。
2.随机片段化：
超声波：可产生300bp的短片段。
切除发夹
TTTTTT AAAAAA
通过以下途径将 cDNA 插入载体 a. 平端克隆 b. 加接头 c. 进一步进行同聚物加尾反应
加接头 2
TTTTTT AAAAAA 经酶切进行定向克隆
分离稀有的cDNA克隆。 建库的关键： 如何产生足够数量的重组DNA 建库应注意： 1.保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA
序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。
组织
mRNA cDNA
甲基化，加接头 的双链 DNA
DNA
部分或完全 消化的 DNA
载体
( 选择一种)
大小分级
可供克隆的 DNA 片段
二. DNA片断大小的分部
如已知含目的基因克隆片段的大小范围， 可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝 胶电泳将DNA群体按大小分部分离。
三.目的基因克隆片段的富集。
) ln(1 I / G)
N:该序列的构建基因组(genomic library)
即基因(gene bank)是含有某种生物体全部基因的随机片断酶切使其成为一定大小的片段，连 接到适当载体(常为噬菌体)上，经体外包装 转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组 噬菌体颗粒。此即是基因。这群DNA片 段含盖基因组全部基因。
五. cDNA 一.概况: cDNA是通过反转录mRNA，并制备双链
cDNA(double strandeA的相对丰度；
(2)筛选方法：
除简单的分子杂交法外还可对表达产易于
筛4)建库时已排除了其它的RNA，使假筛选。
但应注意：
(1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的 mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。