一.λ噬菌体载体
§ 基础：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或 包装后转染宿主细胞。
§ 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 § 重组筛选：
插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基 因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈； 现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。
TTTTTT AAAAAA
切除发夹
TTTTTT AAAAAA
通 过 以 下 途 径 将 cDNA 插 入 载 体 a. 平 端 克 隆 b. 加 接 头 c. 进 一 步 进 行 同 聚 物 加 尾 反 应
加接头 2
TTTTTT AAAAAA 经酶切进行定向克隆
cDNA 克 隆第二节 构建的载体建库的目的： 1.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；的关键： 如何产生足够数量的重组DNA 建库应注意： 1.保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA
序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。
组织
mRNA cDNA
甲基化，加接头 的 双 链 DNA
§ 将数据代入上式
N ln1(0.99) ln1(17kb/30M)b
= 8.1×105 N的含义是克隆大小为1799％是通过反转录mRNA，并制备双链
§ (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或差异A。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
DNA
部分或完全 消 化 的 DNA
载体
( 选择一种)
大小分级
可供克隆的 DNA 片 段
连 接 DNA 片 段 和 载 体
重 组 载 体 DNA 导 入 E.coli (体 外 包 装 或 转 化 )
基因库的鉴定与A 和 cDNA 文 库 的 流 程 示 意 图
三.目的基因克隆片段的富集。
) ln(1 I / G )
N:该序列 I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb; G: 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp
筛选(4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳筛选。
但应注意：
§ (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的 mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。
(a) 随 机 六 碱 基 NNNNNN
AAAAAAA mRNA
第 一 条 cDNA 的 合 成 An
(b)寡 聚 (dT)引 物
An Tn
(c)发 夹 引 物
第 二 条 cDNA 的 合 成
TTTTTT
GGGGGG
CCCCCC
加接头 1
TTTTTT
GGGGGG
AAAAAA
CCCCCC
(d)同 பைடு நூலகம் 物 加A library) ： 克隆的重 组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。
cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,不超过1kb, 但如采用双酶部分消化，产物的分子量 可达10～30kb,它们存在着随机序重叠， 用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片 段群体按大小分开，可得到的分子量大 小约为20kb的随机DNA片段群体。
二. DNA片断大小的分部
如已知含目的基因克隆片段的大小范围， 可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝 胶电泳将DNA群体按大小分部分离。
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
存在的问题：
①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，
cDNA(double stranded对丰度；
(2)筛选方法：
除简单的分子杂交法外还可对表达产rRNA和tRNA因其丰 富和大小的一致性，可以通过分级直接分离)。 mRNA的提取可以通过多胸腺嘧啶的柱子分离。 然后被反转录。cDNA第一链的合成用oligo(dT) 引物，因为长的mRNA没有被完全反转录,因此 中部可加另一引物。第二链cDNA的合成是用 自身引物的，一个更有效的方法是在cDNA第 一链加尾(如多聚胞嘧啶)，然后用oligo(G)为 引物起始第二链的合成。这样产生的双链 cDNA可以通过加接头或同聚尾巴插入载体。
基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。
②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，完整筛出更不容易。
2.随机片段化：
超声波：可产生300bp的短片段。
高速搅拌：1500转/分×30分 长度8kb的分子群体。
可切 平均
3.双酶消化
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考 虑到载体容量，如噬菌体插入片段不超过 25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平 均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平 均长度4096 bp.