胞内细胞因子染色
1.细胞刺激完成后，移去大部分上清液，加200ulFACS或MACS buffer，轻轻混匀。

设计细
胞染色的排放位置并记录，根据设计把细胞转移至染色板里，2000rpm,离心2min，甩去上清，在吸水纸上轻轻拍干，使用的位置不可重复利用(下同)。

2.死细胞染色。

加200ul PBS，轻轻混匀，2000rpm, 离心2min；重复洗涤1次。

此步骤的
目的为洗去培养基中残留的蛋白质。

Dead/Live dye (Violet (BV421 channel), Aqua (BV510 channel), or Zombie Yellow (BV570 channel)用PBS 1:1000稀释，每孔加50 ul，轻轻混匀，避光，室温染色30 min。

然后每孔加200ulFACS buffer，轻轻混匀，2000rpm, 离心2min。

3.表面染色。

A.配制表面染色抗体mix。

根据染色方案计算每个抗体加入量，将抗体按照既定的稀
释比例溶于FACS buffer里，每个抗体加过后需标记，防止加错。

使用前吹打混匀。

B.每孔加入50ul抗体mix，轻轻吹打混匀。

避光，人细胞室温染色15min；小鼠细胞
4℃染色10min。

C.染色后，洗去未结合的多余抗体。

加入200ul FACS buffer 轻轻吹打，2000rpm, 2min
离心，甩去上清。

D.如果使用Biotin偶联的抗体，配制Streptavidin-dye至工作浓度。

每孔50ul,轻轻吹打
后，4℃避光染色10min。

染色结束后加FACS buffer 200ul,2000rpm, 2min离心，甩去上清。

4.固定破膜。

（BD）
A.每孔加入50ul固定破膜液(BD CytoFix/Perm)，轻轻吹打混匀。

避光固定破膜4℃，
20min。

B.配制Perm Wash。

10X浓缩液稀释为1X，即1份浓缩液加9份灭菌水。

C.固定破膜完成后，洗涤2次。

第1次洗涤每孔加入150ul Perm Wash,轻轻吹打，
2000rpm, 2min离心，甩去上清；第2次洗涤每孔加入200ul Perm Wash，,轻轻吹打，2000rpm, 2min离心，甩去上清。

5.胞内染色。

A.配制胞内抗体mix。

抗体按既定稀释比例溶于Perm Wash里，使用前轻轻吹打混匀。

B.每孔加入50ul抗体mix，轻轻吹打混匀。

避光，4℃染色30min。

C.染色后，洗去未结合的多余抗体。

加入200ul Perm Wash轻轻吹打，2000rpm, 2min
离心，甩去上清。

共洗2次。

D.如果使用Biotin偶联的抗体，应用Perm Wash配制Streptavidin-dye。

每孔50ul,轻轻
吹打后，4℃避光染色10min。

染色结束后洗涤，Perm Wash 200ul,1500rpm,3min离心，甩去上清。

共洗2次。

6.重悬过滤。

A.每孔加入200ul FACS buffer，轻轻吹打重悬。

B.用40um滤膜过滤到FACS管里，视细胞量多少，体积可做适当调整，一般为300-500
ul。

注意事项：
1.操作过程中细胞吹打要轻柔。

2.染色也可于EP管内进行。

EP管离心500g, 2min。

3.抗体置于冰上，抗体mix配制时，注意用灭菌枪头，不要污染管内抗体。

配好后避光4℃
保存。